【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于海洋贝类的分类鉴定领域，具体涉及到一种特异性多重pcr鉴定中国常见小蛎属的引物组合、应用和鉴定方法及试剂盒。
技术介绍
1、牡蛎隶属于软体动物门（mollusca）、双壳纲（bivalvia）、 牡蛎目（ostreida）、牡蛎总科（ostreoidea）、牡蛎科（ostreidae ），是我国乃至世界上重要的养殖贝类之一，是沿海地区贝类中较为常见的一类，广泛分布在全球各海域，是重要的渔业和水产养殖物种，具有重要的经济价值和食用价值，很多物种是海岸和河口生态系统维护的关键物种，可以净化水质改善生态环境。牡蛎是世界上外壳变化最大的双壳类之一。传统的方法主要是通过形态学和解剖学作为标记进行研究，随着分子生物学的发展，越来越多的分子手段用来物种分类，包括dna分子杂交技术、核酸限制性内切酶酶切位点分析和直接测序等。但是这些常规技术具有耗时长、样品要求高、费用高等特点，因此更多地限于实验室应用，不适用于如水产养殖等大批量样品的种类鉴定。小蛎属是牡蛎中产量最大、鉴定最为困难的物种，由于物种鉴定的滞后阻碍了我国小蛎属牡蛎的分类、分布及遗传育种等相关研究的进展。急需开发一种多重特异性pcr技术来进行小蛎属牡蛎种类的快速准确鉴定。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种特异性多重pcr鉴定中国常见小蛎属的引物组合、应用和鉴定方法及试剂盒。
2、为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：
3、使用线粒体基因coi设计引物
4、通过genbank
5、将5种小蛎属牡蛎（咬齿牡蛎 s. mordax、棘刺牡蛎 s. echinata、旋形牡蛎 s. circumsuta、多刺牡蛎 s. kegaki、团聚牡蛎 s. malabonensis）的coi基因序列导入bioedit进行多序列比对，序列总长为1500bp，基于101（t）、104（g）、107（t）、111（c）、116（t）、122（g）、125（a）处的特异核苷酸位点设计了团聚牡蛎的正向特异性引物（malftacgaatcacctagatattgggaga），基于1258（c）、1261（g）、1262（c）、1264（g）、1270（c）、1273（c）、1276（g）处的特异核苷酸位点设计了团聚牡蛎的反向特异性引物（malrcacgcgggaaaacagcggg）；基于281（c）、287（a）、290（g）、296（g）处的特异核苷酸位点设计了多刺牡蛎的正向特异性引物（kegf cgtaataccggttatgat），基于1159（c）、1165(c)、1168（t）、1174（t）、1177（c）位点设计了多刺牡蛎的反向引物（kegr ggtatcatgaagggttacg）；基于194（a）、195（c）、197（a）处的核苷酸位点设计了棘刺牡蛎的正向引物（echfgaagactatttaatccgggg），基于668（g）、674（a）、686（c）处的核苷酸位点设计了棘刺牡蛎的反向引物（echr ggtaagaccccctgctaac）；基于518（t）、521（g）、524（t）、527（a）、530（t）、533（g）、534（c）处的核苷酸位点设计了咬齿牡蛎的正向引物（morf tctgcatttagctgggctta），基于731（a）、734（g）、740（t）、743（g）、749（g）处的核苷酸位点设计了咬齿牡蛎的反向引物（morr cggatccccaccacccact）; 基于219（c）、224（c）、227（c）、233（t）、236（c）处的核苷酸位点设计了旋形牡蛎的正向引物（cirf ctagaccccgtttgttac）,基于749（a）、750（a）、758（c）、767（g）处的核苷酸位点设计了旋形牡蛎的反向特异性引物（cirrcaaatgctggaataaaatt）。进而获得鉴定小蛎属引物序列为：
6、morf tctgcatttagctgggctta；
7、morr cggatccccaccacccact；
8、echf gaagactatttaatccgggg；
9、echr ggtaagaccccctgctaac；
10、cirf ctagaccccgtttgttac；
11、cirr caaatgctggaataaaatt；
12、kegf cgtaataccggttatgat；
13、kegr ggtatcatgaagggttacg；
14、malf tacgaatcacctagatattgggaga；
15、malr cacgcgggaaaacagcggg。
16、一种特异性多重pcr鉴定中国常见小蛎属的引物组合，鉴定中国常见小蛎属的引物序列组合；
17、所述小蛎属引物序列为：
18、morf tctgcatttagctgggctta；
19、morr cggatccccaccacccact；
20、echf gaagactatttaatccgggg；
21、echr ggtaagaccccctgctaac；
22、cirf ctagaccccgtttgttac；
23、cirr caaatgctggaataaaatt；
24、kegf cgtaataccggttatgat；
25、kegr ggtatcatgaagggttacg；
26、malf tacgaatcacctagatattgggaga；
27、malr cacgcgggaaaacagcggg。
28、一种所述的引物组合的应用，所述引物组合在鉴定中国常见小蛎属中的应用。
29、所述中国沿海常见小蛎属物种为咬齿牡蛎 s. mordax、棘刺牡蛎 s. echinata、旋形牡蛎 s. circumsuta、多刺牡蛎 s. kegaki、团聚牡蛎 s. malabonensis。
30、一种多重pcr鉴定中国常见小蛎属的鉴定方法，取待检测物种dna为模板，分别采用所述的小蛎属引物组合进行物种特异性多重pcr扩增，根据电泳结果即可鉴定中国常见小蛎属本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性多重PCR鉴定中国常见小蛎属牡蛎的引物组合，其特征在于：鉴定中国常见小蛎属的引物组合；
2.一种权利要求1所述的引物组合的应用，其特征在于：所述引物组合在鉴定中国常见小蛎属牡蛎中的应用。
3.根据权利要求2所述的引物组合的应用，其特征在于：所述中国常见小蛎属物种为咬齿牡蛎S. mordax、棘刺牡蛎S. echinata、旋形牡蛎S. circumsuta、多刺牡蛎S. kegaki、团聚牡蛎S. malabonensis。
4.一种多重PCR鉴定中国常见小蛎属的鉴定方法，其特征在于：取待检测物种DNA为模板，采用权利要求1所述小蛎属引物组合进行物种特异性多重PCR扩增，根据电泳结果即可鉴定中国常见小蛎属牡蛎。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于：所述中国常见小蛎属物种为咬齿牡蛎S. mordax、棘刺牡蛎S. echinata、旋形牡蛎S. circumsuta、多刺牡蛎S. kegaki、团聚牡蛎S. malabonensis。
6.根据权利要求4或5所述的鉴定方法，其特征在于：所述扩增产物中
7.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于：所述多重PCR反应条件为95℃预变性5min，然后95℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸50s，35个循环后，72℃延伸8min。
8.一种特异性多重PCR鉴定中国常见小蛎属的试剂盒，其特征在于：试剂盒中含权利要求1所述引物组合。
...【技术特征摘要】
1.一种特异性多重pcr鉴定中国常见小蛎属牡蛎的引物组合，其特征在于：鉴定中国常见小蛎属的引物组合；
2.一种权利要求1所述的引物组合的应用，其特征在于：所述引物组合在鉴定中国常见小蛎属牡蛎中的应用。
3.根据权利要求2所述的引物组合的应用，其特征在于：所述中国常见小蛎属物种为咬齿牡蛎s. mordax、棘刺牡蛎s. echinata、旋形牡蛎s. circumsuta、多刺牡蛎s. kegaki、团聚牡蛎s. malabonensis。
4.一种多重pcr鉴定中国常见小蛎属的鉴定方法，其特征在于：取待检测物种dna为模板，采用权利要求1所述小蛎属引物组合进行物种特异性多重pcr扩增，根据电泳结果即可鉴定中国常见小蛎属牡蛎。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于：所述中国常见小蛎属物种为咬齿牡蛎s. mordax、棘刺牡蛎s....
【专利技术属性】
技术研发人员：王海艳，卢瑞静，李翠，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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