【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测领域，具体为一种基于荧光pcr熔解曲线分析技术检测ugt1a1基因双位点多态性的试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、伊立替康是(irenotecan，cpt-11)是喜树碱半合成衍生物，在体内经羟酸酯酶水解成7-乙基-10-羟基喜树碱(sn-38)，sn-38是dna拓扑异构酶i的抑制剂，作用于细胞周期s期，抑制、干扰dna修复和转录，阻止或减缓肿瘤细胞生长。伊立替康主要用于治疗成人晚期/转移性大肠癌，对小细胞和非小细胞肺癌及宫颈癌和卵巢癌亦有疗效。然而，伊立替康引起的中性粒细胞减少及迟发性腹泻，成为限制其用药剂量的关键因素之一，这两种副作用均是剂量限制性毒副反应，严重时可能导致患者死亡。
2、研究结果显示，伊立替康的毒性主要是由其活性代谢产物sn-38引起的。sn-38主要与血浆蛋白结合，在发挥完抗肿瘤作用后，活性sn-38通过位于肝脏的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1a1(ugt1a1)的催化作用而转变为无活性的sn-38g，后者再通过尿液、胆汁排出，从而保护健康细胞免受细胞毒性的影响。
3、ugt1a1的多态性与伊立替康不良反应具有密切相关性。该基因的多态性常发生在启动子区,表现为ta重复的个数不同，正常野生型有6个ta重复序列，称为ugt1a1*1。变异后，ta重复的数目发生变化，可以产生5个ta、7个ta或8个ta的重复，分别称为ugt1a1*36、ugt1a1*28、ugt1a1*37。其中ugt1a1*28多态性最常见，包括纯合突变型*28/*28(ta7/ta7)和杂合突
4、综上所述，通过检测ugt1a1*28和ugt1a1*6位点的多态性，可以从基因水平上预测患者对伊立替康的不良反应，对制定临床个体化化疗方案具有重要意义。
5、目前，ugt1a1基因多态性检测的方法主要有直接测序法、聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析(pcr-rflp)法、等位基因特异性pcr(as-pcr)法、基因芯片法等。直接测序法是基因多态性检测最常见的方法，也是基因多态性位点检测的金标准，但该方法存在测序实验操作较为复杂、实验周期较长、工作量大的缺点，不适合于做大量样本的检测。pcr-pflp法依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因，往往出现结果误判现象，影响其检测准确率，另外其检测周期长、通量较低，亦不适用于大量人群的快速筛选。as-pcr根据snp位点的碱基差异设计特异性引物从而检测出突变，方法简便、快捷、费用低廉，但假阳性率较高，对实验条件要求严格。基因芯片快速准确、灵敏度高，缺点是价格昂贵，且无法同时处理大量样本。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于荧光pcr熔解曲线分析技术检测ugt1a1基因双位点多态性的试剂盒及检测方法。
3、(二)技术方案
4、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于荧光pcr熔解曲线分析技术检测ugt1a1基因双位点多态性的试剂盒，包括针对ugt1a1*28和ugt1a1*6位点的特异性扩增引物和荧光标记探针；
5、引物及探针序列为：
6、
7、本专利技术改进有，*标记碱基为硫代修饰，探针的前三个碱基为保护碱基，不是与模板特异结合的序列。
8、本专利技术改进有，探针5’端的荧光基团为fam，3’端的粹灭基团为bhq1。
9、本专利技术改进有，探针5’端的荧光基团可替换为rox、hex、cy5、cy3、vic、texas red或tet；3’端的粹灭基团可替换为bhq2、bhq3或mgb；荧光基团和粹灭基团的位置可以互换。
10、本专利技术进一步提供一种基于荧光pcr熔解曲线分析技术检测ugt1a1基因双位点多态性的检测方法，包括以下步骤：
11、步骤1、提取待测样本的基因组dna，要求浓度大于2ng/μl,od260nm/od280nm＝1.7～2.0,总量大于80μl；
12、步骤2、试剂准备，每次检测前取检测试剂ugt1a1*28标记孔数为检测样数、取检测试剂ugt1a1*6标记孔数为检测样数、取阳性对照试剂ugt1a1*28标记孔1孔、取阳性对照试剂ugt1a1*6标记孔1孔、取阴性对照试剂ugt1a1*28标记孔1孔、取阴性对照试剂ugt1a1*6标记孔1孔；
13、步骤3、样本加样，在和ugt1a1*6标记孔中计入提取的基因组dna20μl每孔；
14、步骤4、阳性对照加样，在阳性对照试剂条ugt1a1*28标记孔和ugt1a1*6标记孔中加入超纯水20μl每孔；
15、步骤5、阴性对照加样，在阴性对照试剂条ugt1a1*28标记孔和ugt1a1*6标记孔中加入超纯水20μl每孔；
16、步骤6、加盖、混匀、离心，检测试剂条、阳性对照试剂条、阴性对照试剂条加样后用备用pcr 8连管盖加盖，震荡混匀10s,离心10s；
17、步骤7、上机检测，进行pcr扩增反应及熔解曲线分析；
18、步骤8、结果判读，在质控结果符合预期的前提下,根据熔解曲线进行结果判定，并根据熔解峰和tm值来判断结果；
19、其中：
20、试剂为冻干剂pcr反应试剂：
21、所述ugt1a1*28检测的冻干粉由0.4μl ugt1a1*28-f(1μm)、0.4μlugt1a1*28-r(10μm)、0.2μl ugt1a1*28-probe(10μm)、4μl 5×pcr buffer、0.48μl taq酶(5u/μl)、5μl冻干保护剂、9.52μl超纯水混合冻干而来，检测时加20uldna模板；
22、所述ugt1a1*6检测的冻干粉由0.4μl ugt1a1*6-f(1μm)、0.4μlugt1a1*6-r(10μm)、0.2μl ugt1a1*6-probe(10μm)、4μl 5×pcr本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于荧光PCR熔解曲线分析技术检测UGT1A1基因双位点多态性的试剂盒，其特征在于，包括针对UGT1A1*28和UGT1A1*6位点的特异性扩增引物和荧光标记探针；
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光PCR熔解曲线分析技术检测UGT1A1基因双位点多态性的试剂盒，其特征在于，其设有盒体、盒盖、白色盖八连管分装的冻干试剂条、红色盖八连管分装的冻干阳性对照试剂条、绿色盖八连管分装的冻干阴性对照试剂条；所述盒盖设在盒体上；盒体内有标准的8*12共96孔PCR管放置孔可放置12条8连管试剂条；8条白色盖八连管分装的冻干试剂条、2条红色盖八连管分装的冻干阳性对照试剂条、2条绿色盖八连管分装的冻干阴性对照试剂条分别插入盒体标准的8*12共96孔PCR管放置孔上；所述试剂条为冻干剂试剂装在0.2ml白色透明8连PCR管内后盖上不同颜色的盖子区分不同试剂分类，所述试剂条的盖子上标注UGT1A1*28或UGT1A1*6区分试剂检测位点；不同颜色的盖子具体为白色盖试剂条为检测试剂、红色盖试剂条为阳性对照试剂、绿色盖试剂条为阴性对照试剂；
3.根据权利要求1所述的一种
4.根据权利要求1所述的一种基于荧光PCR熔解曲线分析技术检测UGT1A1基因双位点多态性的试剂盒，其特征在于：所述的荧光基团包括：FAM、ROX、HEX、Cy5、Cy3、VIC、TexasRed、TET，3’端的粹灭基团包括：BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB；
5.一种基于荧光PCR熔解曲线分析技术检测UGT1A1基因双位点多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种基于荧光PCR熔解曲线分析技术检测UGT1A1基因双位点多态性的检测方法，其特征在于，上机检测PCR扩增和熔解曲线分析程序如下：
...【技术特征摘要】
1.一种基于荧光pcr熔解曲线分析技术检测ugt1a1基因双位点多态性的试剂盒，其特征在于，包括针对ugt1a1*28和ugt1a1*6位点的特异性扩增引物和荧光标记探针；
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光pcr熔解曲线分析技术检测ugt1a1基因双位点多态性的试剂盒，其特征在于，其设有盒体、盒盖、白色盖八连管分装的冻干试剂条、红色盖八连管分装的冻干阳性对照试剂条、绿色盖八连管分装的冻干阴性对照试剂条；所述盒盖设在盒体上；盒体内有标准的8*12共96孔pcr管放置孔可放置12条8连管试剂条；8条白色盖八连管分装的冻干试剂条、2条红色盖八连管分装的冻干阳性对照试剂条、2条绿色盖八连管分装的冻干阴性对照试剂条分别插入盒体标准的8*12共96孔pcr管放置孔上；所述试剂条为冻干剂试剂装在0.2ml白色透明8连pcr管内后盖上不同颜色的盖子区分不同试剂分类，所述试剂条的盖子上标注ugt1a1*28或ugt1a1*6区分试剂检测位点；不同颜色的盖子具体为白色盖试剂条为检测试剂、红色盖试剂条为阳性对照试剂、绿色盖试剂条为阴性对照试剂；
3.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：连加辨，梁耀极，王云铃，夏璐，李珣，赵燕燕，
申请(专利权)人：厦门大学附属第一医院厦门市第一医院，厦门市红十字会医院，厦门市糖尿病研究所，
类型：发明
国别省市：
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