【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及巴氏杆菌的检测，具体涉及用于鉴定a、b、f型牛源多杀性巴氏杆菌的引物和方法。
技术介绍
1、多杀性巴氏杆菌(p.multocida,pm)是牛出血性败血症的病原，该病原在国内养牛场广泛流行，造成了重大的经济损失。2008年以前，引起牛出血性败血症的主要是荚膜血清b型菌株。随着牛多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗(主要成分为灭活的荚膜血清b群多杀性巴氏杆菌)的推广应用，近年来临床上分离到的b型pm菌株逐渐减少。现有资料表明，近10年来从牛场分离到的荚膜血清a型pm逐渐增多，并有f型pm分离株的报道。相对于其他细菌性疾病来说，巴氏杆菌病的潜伏期比较长，因此，在巴氏杆菌病的预防控制工作中，应尽可能消除巴氏杆菌的传染源。由于目前没有针对荚膜a型pm的疫苗，而现有的牛多杀性巴氏杆菌灭活疫苗对a型菌株的交叉保护率低于30％，所以在养殖过程中一旦发现其染上巴氏杆菌病，应立刻采取治疗措施。因此，分离菌株的分型与鉴定是制定针对性的防治措施以及疫苗研发的基础。
2、现行分型方法包括间接血凝试验(iha)、琼脂凝胶免疫扩散试验(agid)、对流免疫电泳试验(ciep)、多重荚膜pcr分型系统。这些分型方法步骤繁琐，操作时间比较长，而且受试验材料限制可能出现无法分型的现象。例如，iha必须用具有凝集性的抗血清进行鉴定，若与所有血清都没有发生凝集反应，则无法用该方法对菌株进行分型，而且iha针对b型和e型菌株更有效；进行agid时所有能引起hs(牛出血性败血症)的血清型菌株均能与2型抗血清反应，与5型抗血清也能发生交叉反应，从而出现误判。
3、因此，亟需开发一种适用于我国多杀性巴氏杆菌分离株鉴定的简便、快速、准确的分型方法。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是针对我国多杀性巴氏杆菌分离株进行快速准确的鉴定。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供用于多重pcr鉴定a、b、f型牛源多杀性巴氏杆菌的引物组，其包括如下引物：
3、kmt1t7：5'-atccgctatttacccagtgg-3'；
4、kmt1sp6：5'-gctgtaaacgaactcgccac-3'；
5、mcp-f：5'-aatgtttgcgatagtccgttaga-3'；
6、mcp-r：5'-atttggcgccatatcacagtc-3'；
7、hspj-f：5'-catttatccaagctccacc-3'；
8、hspj-r：5'-gcccgagagtttcaatcc-3'；
9、orfb-f：5'-aatcggagaacgcagaaatcag-3'；和
10、orfb-r：5'-ttccgccgtcaattactctg-3'；
11、其中kmt1t7/kmt1sp6是多杀性巴氏杆菌的通用pcr引物；mcp-f/mcp-r、hspj-f/hspj-r、orfb-f/orfb-r分别是a型、b型、f型牛源多杀性巴氏杆菌的特异性pcr引物。
12、上述引物组中，各引物在多重pcr反应体系中的摩尔比优选为kmt1t7:kmt1sp6:mcp-f:mcp-r:hspj-f:hspj-r:orfb-f:orfb-r＝1:1:2:2:2:2:16:16。
13、本专利技术还提供用于多重pcr鉴定a、b、f型牛源多杀性巴氏杆菌的试剂盒，其包括上述引物组。
14、所述试剂盒还可以包括pcr通用试剂。
15、所述试剂盒还可以包括电泳通用试剂。
16、上述引物组在制备用于鉴定a、b、f型牛源多杀性巴氏杆菌的产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。
17、上述引物组或试剂盒在鉴定a、b、f型牛源多杀性巴氏杆菌中的应用也属于本专利技术的保护范围。
18、本专利技术还提供一种快速鉴定a、b、f型牛源多杀性巴氏杆菌的方法，其包括：
19、取待测菌样，使用上述引物组进行多重pcr，得到扩增产物；所述多重pcr中各引物之间的摩尔比为kmt1t7:kmt1sp6:mcp-f:mcp-r:hspj-f:hspj-r:orfb-f:orfb-r＝1:1:2:2:2:2:16:16，并且退火温度为53～54℃；
20、检测扩增产物，若同时出现384bp和539bp条带，则待测菌样包含a型牛源多杀性巴氏杆菌；若同时出现384bp和752bp条带，则待测菌样包含b型牛源多杀性巴氏杆菌；若同时出现384bp和873bp条带，则待测菌样包含f型牛源多杀性巴氏杆菌。
21、在一些实施例中，所述多重pcr的反应体系为：2×pcr mix，12.5μl；kmt1t7(10μm)，0.5μl；kmt1sp6(10μm)，0.5μl；mcp-f(10μm)，1μl；mcp-r(10μm)，1μl；hspj-f(10μm)，1μl；hspj-r(10μm)，1μl；orfb-f(100μm)，0.8μl；orfb-r(100μm)，0.8μl；待测菌液，2μl；ddh2o，3.9μl。
22、在一些实施例中，所述多重pcr的反应程序为：98℃2min；98℃10s，53-54℃10s，72℃10s，35个循环；72℃2min。
23、上述方法中，所述待测菌样可为菌液或基因组dna。
24、上述方法中，可以通过核酸测序或凝胶电泳的方法检测扩增产物。
25、我们对我国巴氏杆菌分离株进行了全基因组测序和比较基因组学分析，设计了用于多重pcr鉴定a、b、f型多杀性巴氏杆菌的特异性引物，通过大量检测我国的巴氏杆菌分离株，不断对反应体系与反应条件进行摸索与优化，建立了鉴定a、b、f型多杀性巴氏杆菌的多重pcr方法。本专利技术至少具有以下优点：
26、特异性强：本专利技术的四对引物之间没有相互干扰，能够在同一反应体系中扩增出各自对应的目的基因，从而检测出a型、b型和f型牛源多杀性巴氏杆菌；并且，处于同一反应体系中的四对引物只能扩增各自对应的目的基因，与其它菌株或菌种不存在交叉反应(如图2所示)。因此，本专利技术的引物和方法对a型、b型和f型牛源多杀性巴氏杆菌具有很强的特异性。
27、灵敏度高：本专利技术的方法能够检测出浓度低至1pg/μl的a型牛源多杀性巴氏杆菌的基因组dna、浓度低至1ng/μl的b型牛源多杀性巴氏杆菌的基因组dna以及浓度低至100pg/μl的f型牛源多杀性巴氏杆菌的基因组dna(如图3～5所示)。因此，本专利技术的引物和方法对a型、b型和f型牛源多杀性巴氏杆菌具有很高的灵敏度。
【技术保护点】
1.用于多重PCR鉴定A、B、F型牛源多杀性巴氏杆菌的引物组，其包括如下引物：
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，各引物在多重PCR反应体系中的摩尔比为KMT1T7:KMT1SP6:Mcp-F:Mcp-R:hspJ-F:hspJ-R:OrfB-F:OrfB-R＝1:1:2:2:2:2:16:16。
3.用于多重PCR鉴定A、B、F型牛源多杀性巴氏杆菌的试剂盒，其包括权利要求1或2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR通用试剂。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括电泳通用试剂。
6.权利要求1或2所述的引物组在制备用于鉴定A、B、F型牛源多杀性巴氏杆菌的产品中的应用。
7.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3～5任一所述的试剂盒在鉴定A、B、F型牛源多杀性巴氏杆菌中的应用。
8.一种快速鉴定A、B、F型牛源多杀性巴氏杆菌的方法，其包括：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测菌样为菌液或基因组D
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过核酸测序或凝胶电泳的方法检测扩增产物。
...【技术特征摘要】
1.用于多重pcr鉴定a、b、f型牛源多杀性巴氏杆菌的引物组，其包括如下引物：
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，各引物在多重pcr反应体系中的摩尔比为kmt1t7:kmt1sp6:mcp-f:mcp-r:hspj-f:hspj-r:orfb-f:orfb-r＝1:1:2:2:2:2:16:16。
3.用于多重pcr鉴定a、b、f型牛源多杀性巴氏杆菌的试剂盒，其包括权利要求1或2所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr通用试剂。
5.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文晓，李永清，张坤，程纯结，程晶，江波，周林宜，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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