【技术实现步骤摘要】
【】本专利技术涉及生物，特别涉及特异性靶向scgii基因的sgrna及其应用。
技术介绍
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技术介绍
1、常见的致盲眼底疾病均与异常血管生长有关，而血管的生长需要血管内皮生长因子(vegf)表达上调。目前，研制的多种抗-vegf药物上市，进入临床，应用于老年性黄斑变性、黄斑水肿等与vegf升高相关性的疾病，得到了良好的治疗效果。但抗-vegf药物无差别的抑制生理血管和病理血管的生长，抑制生理血管的生长会影响正常血管的发育。寻找新型的抑制病理性血管生长的药物是基础研究的重要方向，也是临床治疗的进一步需求。
2、现有技术中有学者研究发现：分泌粒蛋白(scg)蛋白家族与新生血管有一定的关联，但是，蛋白家族中有很多蛋白，具体哪种蛋白对视网膜的新生血管有影响？蛋白表达能促进血管生长还是抑制血管生长，并没有进行深入的研究，随着分子生物学技术的发展，基因治疗技术被应用于临床治疗。视网膜下腔注射或玻璃体内注射腺病毒进行基因治疗的手段已经成熟运用。
3、为了进一步研究分泌粒蛋白(scg)对视网膜的影响，我们可以利用腺病毒把携带有crispr敲除系统的质粒带入小鼠视网膜，对造模小鼠的视网膜细胞基因进行靶向敲除，以获得能够对小鼠视网膜生理性血管生长有促进作用，对小鼠病理性血管生长有抑制作用的蛋白或病毒载体，为后续的基因疗法提供强有力的有利依据。
技术实现思路
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技术实现思路
1、鉴于研究进展，有必要进一步研究分泌粒蛋白(scg)对视网膜的影响，
2、为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、特异性靶向scgii基因的sgrna，所述的sgrna由sgrna1和sgrna2组成，所述sgrna1的核酸序列如seq id no.1所示；所述sgrna2的核酸序列如seq id no.2所示。
4、本专利技术还包括一种重组载体，所述重组载体包含如权利要求1所述的sgrna。
5、进一步的，所述重组载体由工具载体pmt649与目的基因片段连接而得；所述目的基因片段的核酸序列如seq id no.3所示。
6、本专利技术还包含所述的重组载体的腺病毒载体。
7、本专利技术还包括所述的腺病毒载体在制备促进生理性血管生长且抑制病理性血管生长药物上的应用。
8、进一步的，所述血管为视网膜血管。
9、本专利技术还包括所述的腺病毒载体在制备治疗、预防和辅助治疗眼底疾病药物上的应用。
10、本专利技术还包括所述重组载体的制备方法，所述方法为：将连接有2个sgrna的目的基因片段插入线性化的工具载体pmt649中，得到重组质粒pse5862；所述目的基因片段的核酸序列如seq id no.3所示；所述目的基因片段的扩增引物对为primer1/primer2，其中，primer1的核酸序列如seq id no.4所示，primer2的核酸序列如seq id no.5所示。
11、本专利技术还包括所述腺病毒载体的制备方法，所述方法为：将连接有2个sgrna的目的基因片段插入线性化的工具载体pmt649中，得到重组质粒pse5862；然后将重组质粒pse5862转化到感受态细胞中，得到转化子，抽取阳性转化子质粒包装至腺病毒中得到所述腺病毒载体；所述目的基因片段的核酸序列如seq id no.3所示；所述目的基因片段的扩增引物对为primer1/primer2，其中，primer1的核酸序列如seq id no.4所示，primer2的核酸序列如seq id no.5所示。
12、本专利技术具有如下有益效果：
13、本申请通过构建一组特异性的sgrna，然后根据该靶位点，设计重组质粒，并将质粒整合到腺病毒载体中，通过sgrna的靶向牵引，实现了对scgii基因的有效敲除，本申请构建的sgrna有2条，与单条sgrna相比，对基因的敲除效率更高；经过动物实验，构建好的腺病毒定向敲除小鼠的scgii基因后，我们发现：scgii基因敲除后不影响正常血管的生长，且能抑制病理性血管的生长，降低因病理性新生血管导致的致盲眼底疾病的发病率。对眼部疾病起到了预防和辅助治疗的作用，是一种针对眼部疾病的新型基因疗法，为今后的眼部疾病提供了一种更简单高效的疗法，为该重组病毒开发成预防眼部疾病的药物提供了理论基础。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.特异性靶向scgII基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA由sgRNA1和sgRNA2组成，所述sgRNA1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述sgRNA2的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求1所述的sgRNA。
3.根据权利要求2所述重组载体，其特征在于，所述重组载体由工具载体PMT649与目的基因片段连接而得；所述目的基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.包含如权利要求2或3任意一项所述的重组载体的腺病毒载体。
5.如权利要求4所述的腺病毒载体在制备促进生理性血管生长且抑制病理性血管生长药物上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述血管为视网膜血管。
7.如权利要求4所述的腺病毒载体在制备治疗、预防和辅助治疗眼底疾病药物上的应用。
8.如权利要求2或3任意一项所述重组载体的制备方法，其特征在于，所述方法为：将连接有2个sgRNA的目的基因片段插入线性化的工具载体PMT649中，得到
9.如权利要求4所述腺病毒载体的制备方法，其特征在于，所述方法为：将连接有2个sgRNA的目的基因片段插入线性化的工具载体PMT649中，得到重组质粒PSE5862；然后将重组质粒PSE5862转化到感受态细胞中，得到转化子，抽取阳性转化子质粒包装至腺病毒中得到所述腺病毒载体；所述目的基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述目的基因片段的扩增引物对为Primer1/Primer2，其中，Primer1的核酸序列如SEQ ID NO.4所示，Primer2的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
...【技术特征摘要】
1.特异性靶向scgii基因的sgrna，其特征在于，所述的sgrna由sgrna1和sgrna2组成，所述sgrna1的核酸序列如seq id no.1所示；所述sgrna2的核酸序列如seq id no.2所示。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求1所述的sgrna。
3.根据权利要求2所述重组载体，其特征在于，所述重组载体由工具载体pmt649与目的基因片段连接而得；所述目的基因片段的核酸序列如seq id no.3所示。
4.包含如权利要求2或3任意一项所述的重组载体的腺病毒载体。
5.如权利要求4所述的腺病毒载体在制备促进生理性血管生长且抑制病理性血管生长药物上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述血管为视网膜血管。
7.如权利要求4所述的腺病毒载体在制备治疗、预防和辅助治疗眼底疾病药物上的应用。
8.如权利要求2或3任意一项所述重组载体的制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐芬，徐帆，邓雯，李敏，钟海彬，崔凌，唐宁宁，蒋莉，陈丽妃，
申请(专利权)人：广西壮族自治区人民医院，
类型：发明
国别省市：
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