【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
技术实现思路
【技术保护点】
1.一种用于AAV产生的工程化细胞，其包含一个或多个稳定整合的核酸分子，所述核酸分子共同包含编码以下每一个的核酸序列：非规范tRNA合成酶；对应非规范tRNA合成酶的非规范tRNA；NC-Rep78；和NC-Rep52；其每一个都可操作地连接至启动子；其中编码NC-Rep78的核酸序列和编码NC-Rep52的核酸序列各自包含是提前终止密码子和对应非规范tRNA的氨基酸密码子两者的密码子。
2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中一个或多个稳定整合的核酸分子包含第一稳定整合的核酸分子，所述第一稳定整合的核酸分子包含编码非规范tRNA合成酶的核酸序列。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于aav产生的工程化细胞，其包含一个或多个稳定整合的核酸分子，所述核酸分子共同包含编码以下每一个的核酸序列：非规范trna合成酶；对应非规范trna合成酶的非规范trna；nc-rep78；和nc-rep52；其每一个都可操作地连接至启动子；其中编码nc-rep78的核酸序列和编码nc-rep52的核酸序列各自包含是提前终止密码子和对应非规范trna的氨基酸密码子两者的密码子。
2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中一个或多个稳定整合的核酸分子包含第一稳定整合的核酸分子，所述第一稳定整合的核酸分子包含编码非规范trna合成酶的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的工程化细胞，其中非规范trna合成酶是吡咯赖氨酰基-trna合成酶(pylrs)。
4.根据权利要求3所述的工程化细胞，其中pylrs包含seq id no:20和21中任一个的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的工程化细胞，其中pylrs包含seq id no:21的氨基酸序列。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的工程化细胞，其中第一稳定整合的核酸分子进一步包含可操作地连接至启动子的选择标记。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的工程化细胞，其中一个或多个稳定整合的核酸分子包含第二稳定整合的核酸分子，所述第二稳定整合的核酸分子包含编码非规范trna的核酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的工程化细胞，其中非规范trna使h-lys(boc)-oh带电。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的工程化细胞，其中非规范trna是pylt u25c。
10.根据权利要求9所述的工程化细胞，其中pylt u25c包含seq id no:22的核酸序列。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的工程化细胞，其中第二稳定整合的核酸分子包含四个核酸序列，所述四个核酸序列各自包含编码pylt u25c的核酸序列并且各自可操作地连接至启动子。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的工程化细胞，其中第二稳定整合的核酸分子进一步包含可操作地连接至启动子的选择标记。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的工程化细胞，其中一个或多个稳定整合的核酸分子包含第三稳定整合的核酸分子，所述第三稳定整合的核酸分子包含编码nc-rep78和nc-rep52的核酸序列。
14.根据权利要求13所述的工程化细胞，其中：nc-rep78在位置17处包含提前终止密码子；nc-rep52在位置233处包含提前终止密码子；或其组合。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的工程化细胞，其中非规范trna合成酶是pylrs，并且非规范trna是pylt u25c。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的工程化细胞，其中编码nc-rep78的核酸序列和编码nc-rep52的核酸序列编码为单个转录物。
17.根据权利要求16所述的工程化细胞，其中单个转录物包含编码seq id no:26-27中任一个的氨基酸序列的核酸序列。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的工程化细胞，其中第三稳定整合的核酸分子进一步包含：编码nc-rep40的核酸序列；编码nc-rep68的核酸序列；或两者。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的工程化细胞，其中工程化细胞是hek293细胞、hela细胞、bhk细胞或sb9细胞。
20.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-19中任一项所述的工程化细胞。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸从5’至3’包含：(i)5’反向末端重复的核酸序列；(ii)多克隆位点；和(iii)3’反向末端重复的核酸序列。
22.根据权利要求22所述的试剂盒，其中多核苷酸是质粒或载体。
23.一种用于aav产生的方法，所述方法包括使根据权利要求1-19中任一项所述的工程化细胞与非规范氨基酸接触。
24.根据权利要求23所述的方法，其中非规范氨基酸是h-lys(boc)-oh。
25.一种用于aav产生的工程化细胞，其包含一个或多个稳定整合的核酸分子，所述核酸分子共同包含编码以下每一个的核酸序列：rep52、da-rep52、rep40或da-rep40；rep78、da-rep78、rep68或da-rep68；e2a或da-e2a；e4orf6或da-e4orf6；varna或da-varna；vp1或da-vp1；vp2或da-vp2；vp3或da-vp3；aap；以及l4 100k或da-l4 100k，和碱基编辑器，每个核酸分子可操作地连接至启动子；其中细胞包含da-rep52、da-rep40、da-rep78、da-rep68、da-e2a、da-e4orf6、da-vp1、da-vp2、da-v3和da-l4100k中至少一个的核酸序列；其中da-rep52、da-rep40、da-rep78、da-rep68、da-e2a、da-e4orf6、da-vp1、da-vp2、da-v3和da-l4100k的核酸序列各自包含修饰密码子。
26.根据权利要求25所述的工程化细胞，其中修饰密码子编码错义密码子，并且其中修饰密码子中胞嘧啶或腺嘌呤的脱氨作用将编码的氨基酸转化为另一种氨基酸。
27.根据权利要求25所述的工程化细胞，其中修饰密码子编码提前终止密码子，并且其中修饰密码子中腺嘌呤的脱氨作用将修饰密码子转化为色氨酸密码子、谷氨酰胺密码子或精氨酸。
28.根据权利要求25所述的工程化细胞，其中修饰密码子编码提前终止密码子，并且其中修饰密码子中胞嘧啶的脱氨作用将编码的氨基酸转化为脯氨酸。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的工程化细胞，其中一个或多个稳定整合的核酸分子包含编码一个或多个ctcf绝缘子的核酸序列。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的工程化细胞，其中一个或多个稳定整合的核酸分子包含第一稳定整合的核酸分子，所述第一稳定整合的核酸分子包含编码da-e2a的核酸序列、编码da-e4orf6的核酸序列以及编码varrna的核酸序列。
31.根据权利要求30所述的工程化细胞，其中第一稳定整合的核酸分子进一步包含编码l4 100k或da-l4 100k的核酸序列。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的工程化细胞，其中第一稳定整合的核酸分子进一步包含可操作地连接至启动子的选择标记。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的工程化细胞，其中da-e2a的核酸序列包含导致一个或多个提前终止密码子的至腺嘌呤或胞嘧啶的一个或多个突变。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的工程化细胞，其中编码da-e2a的核酸序列包含seq id no:39或40的氨基酸序列。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的工程化细胞，其中da-e2a(seq id no:39或40)的位置181和/或324对应导致提前终止密码子的至腺嘌呤的突变。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的工程化细胞，其中da-e4orf6的核酸序列包含导致一个或多个提前终止密码子的至腺嘌呤的一个或多个突变。
37.根据权利要求31-36中任一项所述的工程化细胞，其中编码da-e4orf6的核酸序列包含seq id no:41或42的氨基酸序列。
38.根据权利要求31-37中任一项所述的工程化细胞，其中da-e4orf6(seq id no:41或42)的位置77和/或192对应包含导致提前终止密码子的腺嘌呤的修饰密码子。
39.根据权利要求25-38中任一项所述的工程化细胞，其中一个或多个稳定整合的核酸分子包含第二稳定整合的核酸分子，所述第二稳定整合的核酸分子包含编码da-rep52或da-rep40的核酸序列、编码da-rep78或da-rep68的核酸序列、编码vp1或da-vp1的核酸序列、编码vp2或da-vp2的核酸序列、以及编码vp3或d...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·T·利奥纳德，J·J·甘，C·S·斯塔奇，A·A·K·尼尔森，
申请(专利权)人：阿西莫夫公司，
类型：发明
国别省市：
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