基于核酸适配体荧光能量共振转移的荧光传感法检测四环素类的方法技术

技术编号：40276380 阅读：9 留言：0更新日期：2024-02-02 23:03

本发明专利技术公开了基于核酸适配体荧光共振转移的荧光传感法检测四环素类的方法，将荧光基团修饰的核酸适配体及猝灭基团修饰的互补链杂交后作为荧光探针，免标记、快速、高灵敏度、高特异性定量检测复杂体系中四环素类含量。该方法简单、快速，检测线性范围宽，检出限低，具有较好的检测灵敏度和特异性，在食品、化妆品等方面具有很好的应用前景。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及四环素类检测方法，具体涉及基于核酸适配体荧光能量共振转移的荧光传感法检测四环素类的方法。属于生物检测。

技术介绍

1、四环素类抗生物素(tetracyclines，tcs)是一类具有线性融合四环结构的广谱抗菌剂，通过阻断氨酰基trna与核糖体的连接来抑制细菌蛋白质合成。因其抗菌效果好、副作用小、吸收好、成本相对较低，被广泛用于人类和动物预防和治疗由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的细菌感染。此外，tcs也被用作畜牧业的饲料添加剂，以促进生长。如果将这些成分加入到祛痘类化妆品中，这些物质会诱发菌群失调，引起接触性皮炎、抗生素过敏等症，长期使用还会导致严重的内脏损伤，并危及生命。我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)明确规定甲硝唑、氯霉素及四环素类抗生素为化妆品中禁用物质，不得作为化妆品生产原料及组分添加到化妆品中。

2、到目前为止，tcs检测方法主要包括高效液相色谱(hplc)、液相色谱-串联质谱(lc–ms/ms)、毛细管电泳(ce)和酶联免疫测定法(elisa)。仪器法具有高精度和高灵敏度的优点，但这些仪器分析方法耗时、费力，并且需要熟练的操作员。免疫测定法为仪器方法提供了一种简单而经济的替代方法，然而，这些基于抗原-抗体相互作用的免疫测定方法在很大程度上取决于抗体的质量，抗体效价是逐批变化的，其效价受温度、ph和离子强度等条件影响较大，限制了该方法的推广应用。因此，开发一种简便灵敏、低成本、高效率、有选择性的检测四环素类的方法仍然很有意义。

技术实现思路

1、本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供基于核酸适配体荧光能量共振转移(fret)的荧光传感法检测四环素类的方法。

2、为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：

3、1、一种荧光探针的制备方法，将fdna溶液和cdna溶液按照终浓度比1：1.2加入含mg2+的pbs缓冲液中，得到杂交溶液，退火处理即得，其中，fdna溶液或cdna溶液是将fdna或cdna溶于超纯水并用含mg2+的pbs缓冲液稀释得到；

4、fdna、cdna的核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2所示；

5、5’-6-fam-ctctcgacgacattccgttgatctctcccttttgggttggtgtcgt-3’，seq idno.1；

6、5’-tgtcgtcgagag-bhq1-3’，seq id no.2。

7、优选的，fdna溶液和cdna溶液的终浓度分别为20nmol/l和24nmol/l，杂交溶液的终体积为1ml。

8、优选的，fdna溶液、cdna溶液、pbs缓冲液的体积比为1：1.2：47.8，fdna溶液、cdna溶液的浓度相同。

9、优选的，pbs缓冲液含mg2+浓度为6mmol/l，ph为7.3，所述的mg2+来源于mgcl2。

10、优选的，退火处理的工艺条件为：95℃加热5分钟。

11、优选的，退火处理后自然冷却至室温，置于4℃保存备用。

12、2、一种荧光探针，是通过前述制备方法得到的。

13、3、前述一种荧光探针在四环素类定量检测中的应用。

14、优选的，所述四环素类包括：土霉素、四环素、金霉素、多西环素。

15、4、基于核酸适配体荧光能量共振转移的荧光传感法检测四环素类的方法，具体步骤如下：

16、(1)先将前述荧光探针与含mg2+的pbs缓冲液混合均匀，接着分别加入不同浓度的四环素类标准溶液，混合孵育，利用荧光分光光度计测定四环素类标准溶液加入后的荧光强度增加值，荧光强度增加值与四环素类浓度之间呈线性关系，得到线性回归方程；

17、(2)然后将荧光探针与含mg2+的pbs缓冲液混合均匀，再加入待测溶液，混合孵育，利用荧光分光光度计测定待测溶液加入后的荧光强度增加值，根据线性回归方程确定待测溶液中四环素类浓度。

18、优选的，步骤(1)中，荧光探针、pbs缓冲液、四环素类标准溶液的体积比为5：4：1；当四环素类为土霉素时，相应的土霉素标准溶液的浓度为0～8.0μmol/l；当四环素类为四环素时，相应的四环素标准溶液的浓度为0～30.0μmol/l；当四环素类为金霉素时，相应的金霉素标准溶液的浓度为0～10.0μmol/l；当四环素类为多西环素时，相应的多西环素标准溶液的浓度为0～3.0μmol/l；所述pbs缓冲液含mg2+浓度为6mmol/l，ph为7.3，所述的mg2+来源于mgcl2。

19、优选的，步骤(1)中，混合孵育条件为：室温(25℃)孵育5分钟。

20、优选的，步骤(1)中，当四环素类为土霉素时，土霉素检测的线性回归方程为y＝4.388x+13.84，其中x为土霉素浓度，y为荧光强度增加值，线性回归系数r2为0.9912，检出限为15.59nmol/l；当四环素类为四环素时，四环素检测的线性回归方程为y＝0.8827x+8.194，其中x为四环素浓度，y为荧光强度增加值，线性回归系数r2＝0.9902，检测限为51.54nmol/l；当四环素类为金霉素时，金霉素检测的线性回归方程为y＝3.333x+2.78，其中x为金霉素浓度，y为荧光强度增加值，线性回归系数r2＝0.9937，检测限为10.26nmol/l；当四环素类为多西环素时，多西环素检测的线性回归方程为y＝14.62x+4.15，其中x为多西环素浓度，y为荧光强度增加值，线性回归系数r2＝0.9905，检测限为18.00nmol/l。

21、本专利技术的有益效果：

22、本专利技术公开了基于核酸适配体荧光共振转移的荧光传感法检测四环素类的方法，将荧光基团修饰的核酸适配体及猝灭基团修饰的互补链杂交后作为荧光探针，免标记、快速、高灵敏度、高特异性定量检测复杂体系中四环素类抗生素含量。该方法简单、快速，检测线性范围宽，检出限低，具有较好的检测灵敏度和特异性，在食品、化妆品等方面具有很好的应用前景。

23、在实验系统中，fam荧光基团标记的otc核酸适配体(表示为fdna)与bhq1猝灭基团标记的otc核酸适配体互补dna(表示为cdna)进行杂交，此时，fdna的荧光基团和cdna的猝灭基团相互靠近，发生荧光能量共振转移，导致fam的荧光猝灭；当目标物存在时，由于其高亲和力，fdna会与目标物结合并释放猝灭基团标记的cdna，导致荧光增强。在fam的激发波长(485nm)下，目标物没有被激发，因此不会影响检测。荧光强度的恢复与系统中四环素类抗生素的浓度呈线性相关，从而实现了四环素类抗生素的高灵敏定量检测。

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【技术保护点】

1.一种荧光探针的制备方法，其特征在于，将FDNA溶液和cDNA溶液按照终浓度比1：1.2加入含Mg2+的PBS缓冲液中，得到杂交溶液，退火处理即得，其中，FDNA溶液或cDNA溶液是将FDNA或cDNA溶于超纯水并用含Mg2+的PBS缓冲液稀释得到；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，FDNA溶液和cDNA溶液的终浓度分别为20 nmol/L和24 nmol/L，杂交溶液的终体积为1 mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，FDNA溶液、cDNA溶液、PBS缓冲液的体积比为1：1.2：47.8，FDNA溶液、cDNA溶液的浓度相同；PBS缓冲液含Mg2+浓度为6 mmol/L，pH为7.3，所述的Mg2+来源于MgCl2。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，退火处理的工艺条件为：95℃加热5分钟。

5.一种荧光探针，其特征在于，是通过权利要求1～4中任一项所述制备方法得到的。

6.权利要求5所述一种荧光探针在四环素类定量检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特

8.基于核酸适配体荧光能量共振转移的荧光传感法检测四环素类的方法，其特征在于，具体步骤如下：

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，荧光探针、PBS缓冲液、四环素类标准溶液的体积比为5：4：1；当四环素类为土霉素时，相应的土霉素标准溶液的浓度为0～8.0 μmol/L；当四环素类为四环素时，相应的四环素标准溶液的浓度为0～30.0 μmol/L；当四环素类为金霉素时，相应的金霉素标准溶液的浓度为0～10.0 μmol/L；当四环素类为多西环素时，相应的多西环素标准溶液的浓度为0～3.0 μmol/L；所述PBS缓冲液含Mg2+浓度为6 mmol/L，pH为7.3，所述的Mg2+来源于MgCl2。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，混合孵育条件为：室温孵育5分钟；当四环素类为土霉素时，土霉素检测的线性回归方程为y=4.388x+13.84，其中x为土霉素浓度，y为荧光强度增加值，线性回归系数R2为0.9912，检出限为15.59 nmol/L；当四环素类为四环素时，四环素检测的线性回归方程为y=0.8827x+8.194，其中x为四环素浓度，y为荧光强度增加值，线性回归系数R²=0.9902，检测限为51.54 nmol/L；当四环素类为金霉素时，金霉素检测的线性回归方程为y=3.333x+2.78，其中x为金霉素浓度，y为荧光强度增加值，线性回归系数R²=0.9937，检测限为10.26 nmol/L；当四环素类为多西环素时，多西环素检测的线性回归方程为y=14.62x+4.15，其中x为多西环素浓度，y为荧光强度增加值，线性回归系数R²=0.9905，检测限为18.00 nmol/L。

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【技术特征摘要】

1.一种荧光探针的制备方法，其特征在于，将fdna溶液和cdna溶液按照终浓度比1：1.2加入含mg2+的pbs缓冲液中，得到杂交溶液，退火处理即得，其中，fdna溶液或cdna溶液是将fdna或cdna溶于超纯水并用含mg2+的pbs缓冲液稀释得到；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，fdna溶液和cdna溶液的终浓度分别为20 nmol/l和24 nmol/l，杂交溶液的终体积为1 ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，fdna溶液、cdna溶液、pbs缓冲液的体积比为1：1.2：47.8，fdna溶液、cdna溶液的浓度相同；pbs缓冲液含mg2+浓度为6 mmol/l，ph为7.3，所述的mg2+来源于mgcl2。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，退火处理的工艺条件为：95℃加热5分钟。

5.一种荧光探针，其特征在于，是通过权利要求1～4中任一项所述制备方法得到的。

6.权利要求5所述一种荧光探针在四环素类定量检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述四环素类包括：土霉素、四环素、金霉素、多西环素。

8.基于核酸适配体荧光能量共振转移的荧光传感法检测四环素类的方法，其特征在于，具体步骤如下：

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，荧光探针、pbs缓冲液、四环素类标准溶液的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽霞，易姿，邱志鹏，周金沙，钟菲菲，李奔，汪辉，曾希珂，聂静苑，
申请(专利权)人：长沙市食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：

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