【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工，具体涉及一种重组基因工程菌及(6s)-5-甲基四氢叶酸的制备方法。
技术介绍
1、(6s)-5-甲基四氢叶酸((6s)-5-methyltetrahydrofolate，(6s)-5-mthf)又名左旋甲叶酸、活性甲基叶酸等，是体内叶酸的最终活性形式，含有两个手性碳原子，通常在5,6位双键加氢时6位碳原子会形成旋光异构体。(r,s)-5-mthf为化学合成的甲基叶酸消旋体，(6s)-5-mthf为甲基叶酸天然存在形式。只有天然的(6s)-5-mthf可以直接作用于人体发挥相应的疗效，r型不仅对人体没有任何药效，其在体内积聚过多还会导致患心血管疾病的风险增加。
2、(6s)-5-mthf微溶于水，对光和氧气敏感，(6s)-5-甲基叶酸钙(levomefolatecalcium)是其钙盐形式，水溶性更好，稳定性高，是当前(6s)-5-mthf原料药的最终保存形式。(6s)-5-mthf及其盐的合成方法主要分为三大类，化学法、二氢叶酸还原酶法和代谢工程法。
3、化学法又分为化学拆分法和不对称加氢。化学拆分法使用叶酸为底物还原为四氢叶酸(tetrahydrofolate,thf)，通过对甲苯磺酸或苯磺酸等手性助剂拆分获到光学纯的(6s)-四氢叶酸((6s)-thf)，碱性条件下与甲醛发生甲酰化反应，再使用硼氢化物还原，最终与氯化钙成盐，得到白色固体(6s)-5-甲基四氢叶酸钙；或先合成终产物(6r,6s)-5-mthf，再拆分为(6s)-5-mthf；化学拆分法当前主要存在的问题是合成的中
4、二氢叶酸还原酶法早在1971年就发表过，近几年已经实现产业化。叶酸通过锌粉还原为二氢叶酸，再使用二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,dhfr)偶联葡萄糖酸脱氢酶(gluconate dehydrogenase,gdh)或氢化酶构建nad(p)h辅酶循环系统，利用酶的专一性，合成天然的(6s)-thf，再甲酰化、还原合成(6s)-5-mthf。此方法对比纯化学法合成手性纯度高、收率更可观。
5、代谢工程法依托于菌体体内代谢，使用葡萄糖即可合成(6s)-5-mthf，研究主要集中在对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌一碳代谢途径的改造，以期提高(6s)-5-mthf的产量。由于菌体表现为利用叶酸，但产物(6s)-5-mthf菌体不会主动外排，所以产物一般表现为胞内积累，需要破碎菌体提取，且中间体thf为生物辅酶，关联多条氨基酸合成与代谢，叶酸循环为生物体内一碳代谢的重要途径，代谢通路复杂、调控多样，目前依然处于实验室阶段，产量很低。2022年刘延峰团队(j.agric.food chem.2022,70,19,5849-5859)将改善5-mthf生物合成的关键基因comgc整合到模块化工程枯草芽孢杆菌菌株b89的基因组中，5-mthf合成达到3.41±0.10mg/l，生产率为0.21mg/l/h，这是当前微生物合成的最高水平。通过代谢改造想要达到工业化生产的要求，依然需要大量的研究。
6、虽然目前化学法和二氢叶酸还原酶法合成(6s)-5-mthf已经实现产业化，但难免会使用甲醛或者需要高压的工艺条件，化学拆分需要的苯磺酸等手性助剂也存在残留隐患。因此，本领域有必要开发新的工艺，创建更为温和、安全的(6s)-5-mthf合成工艺。
技术实现思路
1、针对现有技术的问题，本专利技术提供一种重组基因工程菌及(6s)-5-甲基四氢叶酸的制备方法，目的在于将天然的(6s)-5-mthf合成路径中的关键反应酶与葡萄糖脱氢酶辅酶循环系统偶联，构建酶法一锅合成(6s)-5-mthf的工艺路线，实现条件温和、安全和高效的(6s)-5-mthf合成工艺。
2、一种重组基因工程菌，它是包含二氢叶酸还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的对应一种或多种基因的重组大肠杆菌；
3、或分别包含二氢叶酸还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的对应基因的多种重组大肠杆菌的组合。
4、优选的，所述二氢叶酸还原酶对应的基因来源于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、铜绿假单胞菌或缺陷短波单胞菌；优选来源于bacillus subtilis 168二氢叶酸还原酶基因。
5、优选的，所述丝氨酸羟甲基转移酶对应的基因来源于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、铜绿假单胞菌或缺陷短波单胞菌；优选来源于bacillus subtilis168的丝氨酸羟甲基转移酶基因。
6、优选的，所述亚甲基四氢叶酸还原酶对应的基因来源于缺陷短波单胞菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或铜绿假单胞菌；优选来源于brevundimonas diminuta atcc 19146的亚甲基四氢叶酸还原酶基因。
7、优选的，所述葡萄糖脱氢酶对应的基因来源于枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌；优选来源于bacillus subtilis 168的葡萄糖脱氢酶基因。
8、优选的，所述重组大肠杆菌为escherichia coli bl21(de3)。
9、优选的，所述重组基因工程菌是含有重组质粒pet-26b的大肠肝菌；所述重组质粒pet-26b是包含二氢叶酸还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和葡萄糖脱氢酶中至少一种酶的对应基因的pet-26b质粒。
10、本专利技术还提供上述重组基因工程菌在制备(6s)-5-甲基四氢叶酸或其制剂中的用途。
11、本专利技术还提供一种(6s)-5-甲基四氢叶酸的制备方法，包括如下步骤：
12、步骤1，制备含有二氢叶酸还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的粗酶液；
13、步骤2，将原料、辅因子、粗酶液和抗氧化剂投料反应，即得(6s)-5-甲基四氢叶酸；
14、所述原料包括叶酸、葡萄糖和l-丝氨酸；所述辅因子包括nadp+、nad+、plp、zn2+和fad2+；抗氧化剂为维生素c；反应条件避光、除氧，反应温度为10-30℃；反应液ph控制在7.0-7.5范围内。
15、优选的，步骤1所述二氢叶酸还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的粗酶液为权利要求1-8任一项所述重组基因工程菌发酵所得的菌体破碎液；
16、所述菌体破碎液采用重悬于无菌水或中性缓冲液中的20-50％w/v浓度含酶湿菌体通过高压匀浆仪破碎并离心去除细胞碎片制得。...
【技术保护点】
1.一种重组基因工程菌，其特征在于：它是包含二氢叶酸还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的对应一种或多种基因的重组大肠杆菌；
2.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述二氢叶酸还原酶对应的基因来源于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、铜绿假单胞菌或缺陷短波单胞菌；优选来源于Bacillus subtilis168二氢叶酸还原酶基因。
3.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述丝氨酸羟甲基转移酶对应的基因来源于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、铜绿假单胞菌或缺陷短波单胞菌；优选来源于Bacillussubtilis 168的丝氨酸羟甲基转移酶基因。
4.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述亚甲基四氢叶酸还原酶对应的基因来源于缺陷短波单胞菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或铜绿假单胞菌；优选来源于Brevundimonas diminuta ATCC 19146的亚甲
5.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶对应的基因来源于枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌；优选来源于Bacillus subtilis 168的葡萄糖脱氢酶基因。
6.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。
7.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组基因工程菌是含有重组质粒pET-26b的大肠肝菌；所述重组质粒pET-26b是包含二氢叶酸还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和葡萄糖脱氢酶中至少一种酶的对应基因的pET-26b质粒。
8.权利要求1-7任一所述的重组基因工程菌在制备(6S)-5-甲基四氢叶酸或其制剂中的用途。
9.一种(6S)-5-甲基四氢叶酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤1所述二氢叶酸还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的粗酶液为权利要求1-8任一项所述重组基因工程菌发酵所得的菌体破碎液；所述菌体破碎液采用重悬于无菌水或中性缓冲液中的20-50％W/V浓度含酶湿菌体通过高压匀浆仪破碎并离心去除细胞碎片制得。
11.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述叶酸、葡萄糖和L-丝氨酸的投料摩尔比为1:(3-3.5):(2-2.5)；叶酸的底物浓度为0.1-5wt.％。
12.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述辅因子添加量为：NADP+0.1-1wt.‰，NAD+0.1-1wt.‰，PLP添加量0.1-5wt.‰，Zn2+1-5mM，FAD2+0.1-1wt.‰；
13.按照权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述粗酶液添加量为：二氢叶酸还原酶2-10％V/V、丝氨酸羟甲基转移酶0.5-5％V/V、亚甲基四氢叶酸还原酶2-10％V/V和葡萄糖脱氢酶1-5％V/V。
...【技术特征摘要】
1.一种重组基因工程菌，其特征在于：它是包含二氢叶酸还原酶、丝氨酸羟甲基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和葡萄糖脱氢酶的对应一种或多种基因的重组大肠杆菌；
2.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述二氢叶酸还原酶对应的基因来源于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、铜绿假单胞菌或缺陷短波单胞菌；优选来源于bacillus subtilis168二氢叶酸还原酶基因。
3.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述丝氨酸羟甲基转移酶对应的基因来源于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、铜绿假单胞菌或缺陷短波单胞菌；优选来源于bacillussubtilis 168的丝氨酸羟甲基转移酶基因。
4.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述亚甲基四氢叶酸还原酶对应的基因来源于缺陷短波单胞菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或铜绿假单胞菌；优选来源于brevundimonas diminuta atcc 19146的亚甲基四氢叶酸还原酶基因。
5.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述葡萄糖脱氢酶对应的基因来源于枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌；优选来源于bacillus subtilis 168的葡萄糖脱氢酶基因。
6.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌为escherichia coli bl21(de3)。
7.按照权利要求1所述的重组基...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏颖，张磊，赵华，
申请(专利权)人：上海锐康生物技术研发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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