一种制备麦角硫因的方法技术

本发明专利技术提供了一种制备麦角硫因的方法，包括先将组氨酸甜菜碱、L

【技术实现步骤摘要】
一种制备麦角硫因的方法


[0001]本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种生物酶催化制备麦角硫因的方法。

技术介绍

[0002]麦角硫因是1909年在麦角菌中发现的一种含硫醇的特殊氨基酸，随后，在粗糙脉孢菌、蓝细菌、蘑菇等均有发现。人类和其他无脊椎动物不能直接合成他，但它可以通过食物汲取并积累到人体的各个部位，它具有超强的抗氧化能力，已知的抗氧化能力高于维生素E，维生素C，半胱氨酸、谷胱甘肽等，这使得它被广泛应用于食品、化妆品以及医药等行业中。
[0003]麦角硫因结构式如下：
[0004][0005]麦角硫因在好氧生物体内的合成存在来源于细菌生物合成以及来源于真菌生物合成的两条途径。在细菌中涉及到有5个关键酶的基因簇，这5个酶分别是γ
‑
谷氨酰半胱氨酸合成酶(EgtA)、单核非血红素铁酶(EgtB)、酰胺转移酶(EgtC)、S
‑
腺苷蛋氨酸依赖型组氨酸甲基转移酶(EgtD)、磷酸吡哆醛(PLP)结合型C
‑
S裂解酶(EgtE)。在真核生物中的麦角硫因合成主要涉及Egt1和Egt2两个关键酶，Egt1催化半胱氨酸和组氨酸甜菜碱(海西宁)合成中间体海西宁半胱氨酸亚砜(CHER)，然后CHER再由Egt2裂解成麦角硫因。
[0006]目前合成麦角硫因的方法主要有化学法、微生物发酵法、酶促制备。化学法的原料较昂贵，且合成困难，导致产量不足。采用代谢改造进行微生物发酵是现在研究的热点，公开号为CN113234652A的中国专利申请通过将EgtABCDE克隆至大肠杆菌中，并对其进行所需底物的通路进行代谢改造的情况下得到的工程菌，最终发酵108h产量达到1.1g/L。公开号为CN114277042A的中国专利申请报道将粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中克隆得到的麦角硫因合成基因Egt1、Egt2导入并整合到圆红冬孢酵母菌中，其最终通过发酵120h可以达到8.5g/L的产量。与发酵法相比，酶催化法有产率较高、提纯较简单等优点，例如公开号为CN104854245A的中国专利申请报道了体外以组氨酸或组氨酸甜菜碱为底物制备麦角硫因的方法，一种是通过酶EgtABCDE制备，一种是通过蛋白OvoA/酶NcEgtl和酶EgtE制备。虽然公开了相关酶的信息，但是转化周期以及底物转化率是未知的，实际效果能否进行规模化应用尚不明确。
[0007]因此，进一步开发反应时间短、转化率高且工艺步骤精简的酶催化合成麦角硫因的新方法，对促进麦角硫因的工业化、规模化生产具有重要意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种麦角硫因的酶催化合成方法。
[0009]本专利技术提供了一种生物酶催化制备麦角硫因的方法，包括如下步骤：
[0010](1)组氨酸甜菜碱、L
‑
半胱氨酸在亚铁离子和还原剂作用下，加入Egt1酶在温度为25～40℃，pH为6.0～8.0的有氧环境下反应制得中间体CHER；
[0011](2)中间体CHER在辅酶和还原剂作用下，加入Egt2酶在温度为25～40℃，pH为6.0～9.0的条件下反应制得麦角硫因；
[0012]反应式如下：
[0013][0014]进一步地，步骤(1)所述反应温度为25～30℃，pH为6.0～7.5；
[0015]和/或步骤(2)所述反应温度为25～30℃，pH为7.0～8.5。
[0016]更进一步地，步骤(1)所述反应温度为30℃，pH为6.5～7.0；
[0017]和/或步骤(2)所述反应温度为30℃，pH为8.0～8.5。
[0018]进一步地，所述Egt1酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示；
[0019]所述Egt2酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。
[0020]更进一步地，步骤(1)所述加入Egt1酶是加入表达Egt1酶的湿菌体，或加入Egt1酶的粗酶液；步骤(2)所述加入Egt2酶是加入表达Egt2酶的湿菌体，或加入Egt2酶的粗酶液。
[0021]更进一步地，上述Egt1酶的粗酶液或Egt2酶的粗酶液制备方法如下：
[0022](a)制备表达Egt1酶的湿菌体或表达Egt2酶的湿菌体；
[0023](b)步骤(a)制备的湿菌体用PBS缓冲液混旋，均质破碎，离心收集上清液。
[0024]进一步地，上述表达Egt1酶的湿菌体是含有Egt1基因的重组大肠杆菌进行蛋白表达后的菌体；所述表达Egt2酶的湿菌体是含有Egt2基因的重组大肠杆菌进行蛋白表达后的菌体；
[0025]所述Egt1基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示，所述Egt2基因序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示。
[0026]更进一步地，上述表达Egt1酶的湿菌体或表达Egt2酶的湿菌体的制备方法如下：
[0027](a
’
)将Egt1基因或Egt2基因克隆到表达载体中得到重组表达质粒，将重组表达质粒转如大肠杆菌中制得重组菌；优选地，所述表达载体是PET
‑
28a质粒；
[0028](b
’
)重组菌接种、培养，加入亚铁离子、诱导剂诱导蛋白表达并培养，离心收集菌体，即得表达Egt1酶的湿菌体或表达Egt2酶的湿菌体。
[0029]进一步地，步骤(1)所述还原剂是三(2
‑
羧乙基)膦、二硫苏糖醇或巯基乙醇中的一种或多种，步骤(2)所述辅酶是磷酸吡哆醛，所述还原剂是三(2
‑
羧乙基)膦、二硫苏糖醇或巯基乙醇中的一种或多种。
[0030]进一步地，步骤(1)所述组氨酸甜菜碱、L
‑
半胱氨酸、还原剂和Egt1酶的质量比例为(18～23):(15～20):(0.5～1.5):(20～30)；优选为20:16:1:(20～30)；
[0031]和/或步骤(2)所述辅酶、还原剂和Egt2酶与步骤(1)所述还原剂的质量比为(0.1～0.3):(0.3～0.8):(1～3):1，优选为0.2:0.5:2:1。
[0032]本专利技术的有益效果：本专利技术选择路径相对简单的真核生物合成途径，筛选出转化率高的Egt1酶和Egt2酶，在适宜的特定温度、pH条件下实现了体外酶催化制备麦角硫因，其可以在较短时间内完成转化，并且可以达到较高的底物浓度及转化率，工艺操作简单，适合麦角硫因的规模化生产。
[0033]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0034]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物酶催化制备麦角硫因的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)组氨酸甜菜碱、L
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半胱氨酸在亚铁离子和还原剂作用下，加入Egt1酶在温度为25～40℃，pH为6.0～8.0的有氧环境下反应制得中间体CHER；(2)中间体CHER在辅酶和还原剂作用下，加入Egt2酶在温度为25～40℃，pH为6.0～9.0的条件下反应制得麦角硫因；反应式如下：2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述反应温度为25～30℃，pH为6.0～7.5；和/或步骤(2)所述反应温度为25～30℃，pH为7.0～8.5。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述反应温度为30℃，pH为6.5～7.0；和/或步骤(2)所述反应温度为30℃，pH为8.0～8.5。4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述Egt1酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示；所述Egt2酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述加入Egt1酶是加入表达Egt1酶的湿菌体，或加入Egt1酶的粗酶液；步骤(2)所述加入Egt2酶是加入表达Egt2酶的湿菌体，或加入Egt2酶的粗酶液。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Egt1酶的粗酶液或Egt2酶的粗酶液制备方法如下：(a)制备表达Egt1酶的湿菌体或表达Egt2酶的湿菌体；(b)步骤(a)制备的湿菌体用PBS缓冲液混旋，均质破碎，离心收集上清液。7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述表达Egt1酶的湿菌体是含有Egt1基因的重组大肠杆菌进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳颖，张磊，赵华，
申请(专利权)人：上海锐康生物技术研发有限公司，
类型：发明
国别省市：