一种生产三七素的菌株及方法技术

本发明专利技术公开了一种生产三七素的菌株及方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术构建了表达醇脱氢酶、胺脱氢酶、ATP依赖肽合成酶、多聚磷酸激酶2

【技术实现步骤摘要】
一种生产三七素的菌株及方法


[0001]本专利技术涉及一种生产三七素的菌株及方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]三七素(decichine)，又名田七氨酸，化学名称为β
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草酰基
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L
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二氨基丙酸，是五加科人参属名贵中药材三七中的主要止血活性成分，1981年小菅卓夫从三七中首次提取分离三七素，研究进一步证明三七素不仅具有止血功能，增加血小板数量的药理活性，还具有神经保护，减轻糖尿病肾脏损伤，抗炎及降低血糖等多方面的功效。三七素具有一个手性碳原子，因此具有两个异构体l型和d型。三七素作为一种特殊的非蛋白游离氨基酸，在自然界中含量极少，从天然植物中分离得到的均为l构型。随着人们对三七素生物活性和体内代谢特征的不断研究，三七素作为一种高价值的药用成分被越来越受到重视，并成为日后中的研究热点。
[0003]目前三七素的工业化生产还不成熟，大部分还处于实验室研究阶段。小量制备三七素的方法主要有两种：1)利用化学合成的方法制备三七素；采用化学合成的方法，容易面临成本昂贵，中间有多种副产物产生，纯化分离操作较难，并且不容易得到光学纯的D/L三七素。2)通过对五加科植物人参，三七等植物进行处理提取获得。从植物中国呢提取三七素，方法简便，易于实现，质量有保障。但是此方法需要大量的有机溶剂，耗费时间，且提取率不高，因此开发一种有效合成三七素的方法，尤其是绿色微生物合成方法，具有更高效的应用价值。

技术实现思路

[0004]三七素的工业化生产还不成熟，化学合成法和植物提取法都有较大的缺陷，成本高且产率低，亟需一种产量高且绿色环保的方法。
[0005]本专利技术提供了以D/L
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丝氨酸为底物合成D/L
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三七素的方法，丝氨酸在共表达NAD依赖的醇脱氢酶(ADH)和NADH依赖的胺脱氢酶(AmDH)作用下转化为2,3
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二氨基丙酸；ATP依赖的肽键合成酶将2,3
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二氨基丙酸和乙二酸缩合形成三七素，ATP释放能量转化为AMP，利用多聚磷酸激酶PPK2
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II将AMP再生为ADP，多聚磷酸盐激酶2
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I进一步将ADP生成为ATP。
[0006]本专利技术提供了醇脱氢酶、胺脱氢酶、肽键合成酶、多聚磷酸盐激酶2
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I和多聚磷酸盐激酶2
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II在合成三七素的应用。
[0007]在一种实施方式中，所述应用是以羧酸为底物，以醇脱氢酶、胺脱氢酶、肽键合成酶、多聚磷酸盐激酶2
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I和多聚磷酸盐激酶2
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II或过表达醇脱氢酶、胺脱氢酶、肽键合成酶、多聚磷酸盐激酶2
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I、多聚磷酸盐激酶2
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II的微生物细胞作为催化剂催化合成三七素。
[0008]在一种实施方式中，所述羧酸为D/L
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丝氨酸和乙二酸。
[0009]在一种实施方式中，所述过表达是将编码醇脱氢酶、胺脱氢酶、肽键合成酶、多聚磷酸盐激酶2
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I、多聚磷酸盐激酶2
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II的基因中的一个或多个基因通过载体表达，或整合到宿主的基因组上进行表达。
[0010]在一种实施方式中，所述过表达是采用一个载体共表达上述5种酶的基因；或采用多个载体共表达上述5种酶的基因，每个载体表达至少1种酶的基因，且每个载体表达的基因各不相同。
[0011]在一种实施方式中，所述过表达是一个载体上表达1～5种酶的基因：一个载体表达1种酶基因；或一个载体共表达5种酶基因；或一个载体共表达2～3种酶基因，其中编码醇脱氢酶的基因和胺脱氢酶的基因在一个载体上，编码多聚磷酸激酶2
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I和多聚磷酸激酶2
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II的基因在另一个载体上。
[0012]在一种实施方式中，将编码5种酶的基因连接到载体时，每个基因前都含有T7启动子和RBS结合点，每个基因后都带有T7终止子。
[0013]在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pETDuet
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1、pACYCDuet
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1、pRSFDuet
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1、pCDFduet
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1和pCOLDⅡ。
[0014]在一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌为宿主，包括但不限于Escherichia coli BL21(DE3)。
[0015]在一种实施方式中，所述醇脱氢酶来自于Saccharomyces cerevisiae S288C，Aeropyrum pernix K1，Thermus thermophilus HB8，Clostridium beijerinckii或Lactobacillus reuteri DSM20016。
[0016]在一种实施方式中，所述醇脱氢酶的氨基酸序列的NCBI上accession number分别为NP_014555.1，BAA81251.2，WP_011228103.1，WP_012060249.1和ABQ83742.1；相对应的核苷酸序列的NCBI上accession number为NC_001147.6，APE_2239.1，NC_006461.1，LZZG01000005.1，NC_009513.1。
[0017]在一种实施方式中，所述胺脱氢酶来自于Burkholderia ambifariaAMMD，Vibriofurnissii，Rhodococcuspyridinivorans或Pseudomonasyamanorum。
[0018]在一种实施方式中，所述胺脱氢酶的氨基酸序列的NCBI上accession number分别为WP_011659448.1，WP_004726087.1，WP_033097867.1和WP_063029039.1；相对应的核苷酸序列的NCBI上accession number为NC_008391.1，NZ_CP040990.1，NZ_FNRX01000002.1，NZ_CP012400.2。
[0019]在一种实施方式中，所述肽键合成酶来自于Streptomyces rimosus，Acinetobacter lactuca，Trichoderma virens Gv29
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8，Rhodococcus erythropolis PR4或Bacillus safensis。
[0020]在一种实施方式中，所述肽键合成酶的氨基酸序列的NCBI上accession number分别为WP_050504588.1，WP_016145237.1，XP_013952649.1，WP_020907735.1和WP_048238116.1；相对应的核苷酸序列的NCBI上accession number为NZ_CP023688.1，NZ_KB976991.1，NW_014013663.1，NC_0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.醇脱氢酶、胺脱氢酶、肽键合成酶、多聚磷酸盐激酶2
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I和多聚磷酸盐激酶2
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II在合成三七素中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以羧酸为底物，以醇脱氢酶、胺脱氢酶、肽键合成酶、多聚磷酸盐激酶2
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I和多聚磷酸盐激酶2
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II或过表达醇脱氢酶、胺脱氢酶、肽键合成酶、多聚磷酸盐激酶2
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I、多聚磷酸盐激酶2
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II的微生物细胞作为催化剂催化合成三七素；所述羧酸为D/L
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丝氨酸和乙二酸。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述过表达是将编码醇脱氢酶、胺脱氢酶、肽键合成酶、多聚磷酸盐激酶2
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I、多聚磷酸盐激酶2
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II的基因中的一个或多个基因通过载体表达，或整合到宿主的基因组上进行表达。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述过表达是采用一个载体共表达5种酶的基因；或采用多个载体共表达5种酶的基因，每个载体表达至少1种酶的基因，且每个载体表达的基因各不相同。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述载体包括但不限于pETDuet
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1、pACYCDuet
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1、pRSFDuet
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1、pCDFduet
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【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，梁鑫鑫，丁彦蕊，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：