【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程发酵，具体涉及一种高效生物合成羟基酪醇的重组基因工程菌。
技术介绍
1、羟基酪醇作为第一个被欧洲食品监察局批准为食品添加剂的天然酚类化合物，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗氧化、抗血栓等作用，可被广泛应用于食品、医疗、化妆品、农业等领域，是近年来的明星药物和研究热点药物。其在人类身体健康、功能保健方面效果卓越，能实现一药多用，可满足各类人群、各个方面的所有需求，其消费市场非常广阔，市场前景极其可观。
2、目前工业上一般采用分离提取法从新鲜橄榄叶、橄榄果渣和橄榄油废水中提取羟基酪醇。然而此法虽然原料丰富易得，但提取过程中要求使用大量溶剂，且橄榄中羟基酪醇含量低，因此导致回收率低、产量小、成本高。而通过酪醇、2，3-二羟基苯甲醛以及邻苯二酚等前体作为催化底物的化学合成，也有着废水量大、反应步骤繁琐、产率低等缺点，不适合应用于大规模生产。生物合成或生物转化是目前生产羟基酪醇最为高效清洁的方法，此法生产过程环保无害、周期短暂且杂质低更易于纯化分离。在最新的研究中，唐双焱团队将蛋白质工程与启动子工程结合，打造出首个羟基酪醇的全细胞生物传感器，实现酪氨酸到羟基酪醇95％的转化率，发酵罐产量达到4.7g/l(nature communications,2019,10(1):960)，由于其产量有限，不利于工业化推广应用。专利cn114574417a构建的重组大肠杆菌催化多巴胺合成羟基酪醇的产量可达146g/l，但其以左旋多巴为底物，再加上生物静息细胞转化法对细胞的活性要求，使之实际生产成本高，也不利于实际大生
3、虽然对于羟基酪醇的研究已经取得了一定进展，但是对于羟基酪醇的工业化生产还有很大的难度。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种高效生物合成羟基酪醇的重组基因工程菌，它是包含酮酸脱羧酶基因kdc、醇脱氢酶基因adh、4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpabc，谷氨酸脱氢酶基因gdh，吡啶核苷酸转氢酶基因pntab的重组大肠杆菌；
2、所述4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpabc是基因hpab和基因hpac通过刚性linker连接而成。
3、进一步地，所述基因hpab的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2或seq idno.3所示；
4、所述基因hpac的核苷酸序列为seq id no.4、seq id no.5或seq id no.6所示；
5、所述刚性linker的核苷酸序列如seq id no.16所示。
6、进一步地，所述酮酸脱羧酶基因kdc的核苷酸序列如seq id no.9所示，醇脱氢酶基因adh的核苷酸序列如seq id no.10所示，谷氨酸脱氢酶基因gdh的核苷酸序列如seq idno.12所示，吡啶核苷酸转氢酶基因pntab的核苷酸序列如seq id no.13所示。
7、进一步地，所述重组大肠杆菌不含葡萄糖转运蛋白基因ptsg、丙酮酸激酶基因pyka、丙酮酸激酶基因pykf、苯乙醛氧化酶基因feab、氨基转移酶基因tyrb和预苯酸脱氢酶基因tyra。
8、进一步地，所述葡萄糖转运蛋白基因ptsg的核苷酸序列如seq id no.17所示，丙酮酸激酶基因pyka的核苷酸序列如seq id no.18所示、丙酮酸激酶基因pykf的核苷酸序列如seq id no.19所示、苯乙醛氧化酶基因feab的核苷酸序列如seq id no.20所示、氨基转移酶基因tyrb和预苯酸脱氢酶基因tyra的核苷酸序列如seq id no.21所示；预苯酸脱氢酶基因tyra如seq id no.22所示。
9、进一步地，所述重组大肠杆菌还含有预苯酸脱氢酶基因tyraopt，其核苷酸序列如seq id no.7所示。
10、进一步地，所述重组大肠杆菌的莽草酸途径基因由强启动子plpp启动；所述莽草酸途径基因包括arogfbr、ppsa、aroe、arol、aroc、arob、tkta、tyraopt；所述强启动子plpp的核苷酸序列如seq id no.8所示。
11、进一步地，所述大肠杆菌包括bw25113、bw2952、bl21(de3)、mg1665、w3110、dh10b、mds42或其衍生菌。
12、本专利技术还提供了一种前述重组基因工程菌的制备方法，它包括如下步骤：
13、1)取大肠杆菌，敲除葡萄糖转运蛋白基因ptsg、丙酮酸激酶基因pyka、丙酮酸激酶基因pykf、苯乙醛氧化酶基因feab以及氨基转移酶基因tyrb，再将莽草酸途径基因的原始启动子替换为强启动子plpp，最后将莽草酸途径基因中的预苯酸脱氢酶基因tyra替换成tyraopt，得重组菌株；
14、2)取酮酸脱羧酶基因kdc、醇脱氢酶基因adh，分别连接到载体petdute1上；取4-羟基苯乙酸-3单加氧酶基因hpabc，谷氨酸脱氢酶基因gdh和吡啶核苷酸转氢酶基因pntab，分别连接到载体pcs27上；
15、所述载体petdute1和载体pcs27上的原始启动子和原始rbs位点分别被替换成强启动子ptac和强rbs结合位点；
16、所述原始启动子的核苷酸序列如seq id no.23所示，原始rbs位点的核苷酸序列如seq id no.24所示，强启动子ptac的核苷酸序列如seq id no.14所示，强rbs结合位点的核苷酸序列如seq id no.15所示。
17、本专利技术还提供了一种高效生物合成羟基酪醇的方法，它是以葡萄糖、甘油或酪氨酸为底物，用前述的重组基因工程菌发酵。
18、进一步地，所述发酵用培养基的组成为：
19、5-10g/l na2hpo4、3-8g/l kh2po4、4-10g/l(nh4)2so4、0.5-1.5g/l nacl、2-3mmmgso4、0.5-1mm cacl2、20-40g/l glucose、30-60g/l glycerol、10-20g/l酵母提取物、0.01-0.1mg/l h3bo3、0.1-1mg/l cucl2、0.1-1mg/l na2edta、0.1-1mg/l cocl2、0.5-2mg/lzncl2、1-3mg/l mncl2、1-4mg/l fecl2，其余为水；
20、所述发酵的条件为：摇瓶发酵的温度是30-37℃，ph值6-7之间，转速是150-250rpm；发酵罐发酵的温度28-36℃，ph值6-7，初始溶氧30-40％，罐压0-5pa。
21、本专利技术一种高效生物合成羟基酪醇的重组基因工程菌，通过将原始的启动子替换为强启动子，并通过crispr基因编辑技术阻断竞争途径，从而加强了莽草酸途径，极大的促进了前体酪氨酸的供应。用高特异性、高催化酶活的酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、4-羟基苯乙酸-3单加氧酶，谷氨酸脱氢酶，吡啶核苷酸转氢酶，最大程度开拓了从简单碳源到羟基酪醇的酶通量本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效生物合成羟基酪醇的重组基因工程菌，其特征在于：它是包含酮酸脱羧酶基因kdc、醇脱氢酶基因adh、4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpabc，谷氨酸脱氢酶基因gdh，吡啶核苷酸转氢酶基因pntab的重组大肠杆菌；
2.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述基因hpab的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示；
3.根据权利要求1或2所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述酮酸脱羧酶基因kdc的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，醇脱氢酶基因adh的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，谷氨酸脱氢酶基因gdh的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，吡啶核苷酸转氢酶基因pntab的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpabc的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
4.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌不含葡萄糖转运蛋白基因ptsG、丙酮酸激酶基因pykA、丙酮酸激酶基因pykF、苯乙醛氧化
5.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌还含有预苯酸脱氢酶基因tyrAopt，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌的莽草酸途径基因由强启动子Plpp启动；所述莽草酸途径基因包括aroGfbr、ppsA、aroE、aroL、aroC、aroB、tktA、tyrAopt；所述强启动子Plpp的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
7.根据权利要求1～6任一项所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌包括BW25113、BW2952、BL21(DE3)、MG1665、W3110、DH10B、MDS42或其衍生菌。
8.一种权利要求1所述重组基因工程菌的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
9.一种高效生物合成羟基酪醇的方法，其特征在于：它是以葡萄糖、甘油或酪氨酸为底物，用权利要求1-7任一项所述的重组基因工程菌发酵。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述发酵用培养基的组成为：
...【技术特征摘要】
1.一种高效生物合成羟基酪醇的重组基因工程菌，其特征在于：它是包含酮酸脱羧酶基因kdc、醇脱氢酶基因adh、4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpabc，谷氨酸脱氢酶基因gdh，吡啶核苷酸转氢酶基因pntab的重组大肠杆菌；
2.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述基因hpab的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示；
3.根据权利要求1或2所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述酮酸脱羧酶基因kdc的核苷酸序列如seq id no.9所示，醇脱氢酶基因adh的核苷酸序列如seq id no.10所示，谷氨酸脱氢酶基因gdh的核苷酸序列如seq id no.12所示，吡啶核苷酸转氢酶基因pntab的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpabc的核苷酸序列如seq id no.11所示。
4.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌不含葡萄糖转运蛋白基因ptsg、丙酮酸激酶基因pyka、丙酮酸激酶基因pykf、苯乙醛氧化酶基因feab、氨基转移酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：马兴荣，张逸帆，谢荣，高虎涛，温国君，
申请(专利权)人：上海锐康生物技术研发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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