一种用于(-)-α-红没药醇合成的基因及高产(-)-α-红没药醇菌株的构建制造技术

本发明专利技术属于基因重组发酵技术领域，具体涉及一种用于(

【技术实现步骤摘要】
一种用于(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成的基因及高产(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇菌株的构建


[0001]本专利技术属于基因重组发酵
，具体涉及一种用于(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成的基因及高产(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇菌株的构建。

技术介绍

[0002]红没药醇是一种有机化合物，分子式为C
15
H
26
O，是一种存在天然精油中无毒的倍半萜烯醇；在自然界中以两种结构形式存在：β和α。β
‑
红没药醇是从玉米和棉花中收获的，主要用作调味剂。(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇主要存在于春黄菊精油中，含量达17％，其右旋体存在于胶杨精油以及某些苦槛蓝属和鼠尾草属的精油中，具有消炎、灭菌、愈合溃疡、溶解胆石等药效，故在医药行业中的用途较广。
[0003](
‑
)
‑
α
‑
红没药醇能够保护和治愈皮肤，使其免受日常张力的影响，能够加速皮肤的治愈过程，尤其适用于作为敏感皮肤和身体，被广泛应用于个人护肤(皮肤和身体的护理液、须后水和晒后护理产品)的配方中，加上其抗炎、天然、安全特性，使其成为一种用于皮肤护理的常用活性成分。国际上仅个人护理产品上的应用年需求量达到400t以上，逐渐成为个人护肤品原料新宠；此外，(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇香气清淡愉快，也是一种稳定性较好的定香剂，在香料香精中的应用也日益受到重视；然而，(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇作为次级代谢产物，纯天然从植物提取的量俨然无法满足市场的需求，因其受制于生物生长周期，环境等各种因素，扩大生产规模会导致生态环境的破坏甚至物种灭绝；若采用化学合成方法，α
‑
红没药醇复杂手性化学结构，使得直接化学合成难度高，生物活性低以及纯度低等弊端。因此，利用合成生物学构建工程菌实现以廉价的碳源和培养基生产具有高附加值的(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇是一条最具有潜力的途径。
[0004]目前文献报道中，利用基因工程菌生产(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇，发酵罐取得一定成果，但摇瓶产量并不理想；2016年Gui Hwan Han等人以大肠杆菌为宿主细胞，通过质粒过表达德国洋MVA途径，从而获得最终产(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇基因工程菌，发酵48h后产量仅甘菊来源的(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶MrBBS、大肠杆菌来源的ispA以及外源性为0.08g/L。2018年江苏大学王崇龙等人通过筛选不同来源的(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶以及优化最后两步酶的表达量，最终获得一株产(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇大肠杆菌基因工程菌，摇瓶发酵48h产量为2g/L。
[0005]为了达到更好的产量，实现更加高效的(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇发酵生产，仍然有必要对产(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇大肠杆菌基因工程菌进行进一步的优化。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的问题，本专利技术提供一种产(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇的重组基因工程菌及其制备方法和用途，通过对重组基因工程菌所携带的基因类型的优化，实现更高的(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇产量。
[0007]一种产(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇的重组基因工程菌，它是在包含(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶
EeBOS基因、法尼基二磷酸合酶ispA基因以及MVA途径基因的重组大肠杆菌。
[0008]优选的，所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶EeBOS基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)来自巴西棕榈树并且根据大肠杆菌进行密码子优化，所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶EeBOS基因的优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]优选的，所述MVA途径基因包含括甲羟戊酸激酶mvaK1基因、甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶idi基因、乙酰
‑
CoA乙酰转移酶ERG10基因、羟甲基戊二酰辅酶A合酶HMGS基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2基因中的至少一种。
[0010]优选的，所述乙酰
‑
CoA乙酰转移酶ERG10基(NCBI
‑
ProteinID:NP_015297)、羟甲基戊二酰辅酶A合酶HMGS基因(NCBI
‑
ProteinID:NP_013580)和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2(NCBI
‑
ProteinID:NP_013555)基因来自酵母；
[0011]所述甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因(NCBI
‑
ProteinID:AAK74549)、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因(NCBI
‑
ProteinID:AAK74550)和甲羟戊酸激酶mvaK1基因(NCBI
‑
ProteinID:AAK74548)来自肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae；；
[0012]所述法尼基二磷酸合酶ispA(NCBI
‑
ProteinID:BAE76201)和异戊烯二磷酸δ异构酶idi基因(NCBI
‑
ProteinID:BAE76954)来自大肠杆菌。
[0013]优选的，所述重组基因工程菌在基因组上不含有或敲除了葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶pgi基因(NCBI
‑
ProteinID:BAE78027)和NAD(P)转氢酶sthA基因(NCBI
‑
ProteinID:BAE77349)中的至少一种。
[0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇的重组基因工程菌，其特征在于：它是在包含(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶EeBOS基因、法尼基二磷酸合酶ispA基因以及MVA途径基因的重组大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶EeBOS基因来自巴西棕榈树并且根据大肠杆菌进行密码子优化，所述(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶EeBOS基因的优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述MVA途径基因包含括甲羟戊酸激酶mvaK1基因、甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶idi基因、乙酰
‑
CoA乙酰转移酶ERG10基因、羟甲基戊二酰辅酶A合酶HMGS基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2基因中的至少一种。4.根据权利要求3所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述乙酰
‑
CoA乙酰转移酶ERG10基因、羟甲基戊二酰辅酶A合酶HMGS基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2基因来自酵母；所述甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因和甲羟戊酸激酶mvaK1基因来自肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae；所述法尼基二磷酸合酶ispA和异戊烯二磷酸δ异构酶idi基因来自大肠杆菌。5.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组基因工程菌在基因组上不含有或敲除了葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶pgi基因和NAD(P)转氢酶sthA基因中的至少一种。6.根据权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组基因工程菌的质粒过表达转氢酶pntA和pntB基因。7.根据权利要求1
‑
6任一项所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌为土壤筛选得到的重组大肠杆菌E.coli DH5a或重组大肠杆菌E.coli W3110。8.根据权利要求1
‑
6任一项所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组基因工程菌是含有重组质粒pSTV28
‑
2和重组质粒pTrc99A
‑
1的大肠肝菌；所述重组质粒pSTV28
‑
2是含有(
‑
)
‑
α
‑
红没药醇合成酶EeBOS基因、法尼基二磷酸合酶ispA基因、甲羟戊酸激酶mvaK1基因、甲羟戊酸5
‑
焦磷酸脱羧酶mvaD基因、磷酸甲羟戊酸激酶mvaK2基因、异戊烯基二磷酸δ
‑
异构酶idi基因、乙酰
‑
CoA乙酰转移酶ERG10基因、羟甲基戊二酰辅酶A合酶HMGS基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2基因以及转氢酶pntAB基因的pSTV28质粒；所述重组质粒pTrc99...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛巧利，童丽珍，韩照晰，
申请(专利权)人：上海锐康生物技术研发有限公司，
类型：发明
国别省市：