【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，具体涉及一种超小型rna碱基编辑器及其应用。
技术介绍
1、单核苷酸突变是最常见，也是最大的一类致病突变。据clinvar数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)显示，在人类的致病遗传变异中，单碱基点突变的占比接近60％。c/g到t/a，a/t到g/c突变引起致病单核苷酸突变的分别约占点突变的48％与14％。亟需能高效精准修复致病突变的基因组编辑工具。目前有多种潜在的碱基编辑技术可用于碱基突变疾病治疗，常见的有abe(adenine base editor)，cbe(cytosine baseeditor)，pe(prime editor)及其衍生编辑工具。这些crispr/cas9依赖的dna碱基编辑技术可实现碱基修复，但是存在安全隐患。细菌来源的cas蛋白可能会引发人体免疫反应。并且一旦出现基因组水平上的脱靶，将会是永久性的、不可逆的。此外，如果编辑元件尺寸较大，药物的体内递送也受到限制。
2、而rna碱基编辑技术是在rna水平上进行的，不会对基因组序列进行永久改变，因此安全性较高。crispr-cas13是一类新型靶向rna编辑的基因编辑系统。目前该系统已经广泛应用于rna敲除、修饰、单碱基编辑及rna病毒检测等研究领域。相较于dna编辑，rna编辑不会永久改变基因组遗传信息，对rna进行精准编辑，在疾病治疗的安全性和临床转化方面有更强的优势。2017年，张锋团队利用dpspcas13b蛋白融合脱氨酶adar2，开发出第一代rna碱基编辑器，r
3、本专利技术通过对目前已知的最小的天然cas13蛋白，chicas13j进行工程截短改造，构建微小型的repair与rescue编辑器，对于点突变疾病的治疗具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术旨在通过对chicas13j蛋白进行工程化改造，构建截短型chicas13j突变体，从而开发一系列微小型rna碱基编辑器，使得新型rna编辑器可以高效的被包装于单个aav中，实现内源及个体的高效rna编辑，更好的服务于基于疾病治疗的rna编辑治疗与新型药物研发。
2、一种cas13蛋白突变体，由野生型cas13蛋白突变得到，所述野生型cas13蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体突变为以下任意一种：
3、(1)n端截掉36个氨基酸，将剩余氨基酸序列的第31、221和222位氨基酸分别由组氨酸突变为丙氨酸；(2)c端截掉48个氨基酸，将剩余氨基酸序列的第19、257和258位氨基酸分别由组氨酸突变为丙氨酸；(3)n端截掉36个氨基酸，c端截掉48个氨基酸，将剩余氨基酸序列的第31、221和222位氨基酸分别由组氨酸突变为丙氨酸。(1)中，在野生型cas13蛋白n端截掉36个氨基酸后，得到截短的cas13蛋白(388aa)，将剩余氨基酸序列的第19、257和258位氨基酸分别由组氨酸突变为丙氨酸，其中的第31、221和222位氨基酸表示为截短的cas13蛋白(388aa)氨基酸序列中的第31、221和222位氨基酸；在(2)和(3)中同理。
4、其中野生型cas13蛋白为chicas13j蛋白，来源于chitinophagaceae菌，蛋白大小为424个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.1所示，是目前自然界中发现的最小的cas13蛋白。chicas13j在其蛋白的n端和c端具有靶向rna切割的rxxxxh hepn基序，本专利技术在保留切割活性结构域的条件下，分别对其n端和c端的序列进行截短，分别形成了三个新的chicas13j蛋白，命名为truncated chicas13j1(388aa)，truncatedchicas13j2(376aa)和truncated chicas13j3(340aa)(图1)。这三个截短型蛋白是目前已报道的最小的cas13蛋白。
5、本专利技术选择mcherry-target荧光报告载体进行truncated chicas13j蛋白的活性验证。将mcherry-target荧光报告载体，truncated chicas13j表达载体与靶向sgrna序列共转染至hek293t细胞中，同时设置rxxxxh突变的失活truncated dchicas13j与non-target的实验对照组。实验结果表明，三个truncated chicas13j具有极高的mcherry-target mrna靶向敲降活性，敲降效率达60％以上(图2)。
6、本专利技术使用点突变试剂盒对truncated chicas13j进行n端和c端rxxxxh hepen结构域中最后一个氨基酸h(即组氨酸)的突变(h＞a(丙氨酸)突变)，形成无切割rna活性的truncated dchicas13j，即分别为truncated dchicas13j1，truncated dchicas13j2与truncated dchicas13j3。
7、本专利技术还提供了编码所述cas13蛋白突变体的基因。本专利技术还提供了一种包含所述基因的表达载体。上述载体中，还包括核定位信号，序列为cctaagaaaaagcgtaaggtc，载体中表达启动子为cmv启动子。本专利技术还提供了一种超小型rna碱基编辑器，包括所述的基因。所述超小型rna碱基编辑器，还包括核定位信号。
8、所述超小型rna碱基编辑器是将repairv2单碱基编辑器或rescue-s rna单碱基编辑器中的dcas13b的序列替换为所述的基因，同时将repairv2单碱基编辑器或rescue-srna单碱基编辑器中的核输出信号序列替换为核定位信号序列得到。
9、本专利技术还提供了所述超小型rn本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Cas13蛋白突变体，其特征在于，由野生型Cas13蛋白突变得到，所述野生型Cas13蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体突变为以下任意一种：
2.编码权利要求1所述Cas13蛋白突变体的基因。
3.一种包含权利要求2所述基因的表达载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，还包括核定位信号，表达启动子为CMV启动子。
5.一种超小型RNA碱基编辑器，其特征在于，包括权利要求2所述的基因。
6.如权利要求5所述超小型RNA碱基编辑器，其特征在于，还包括核定位信号。
7.如权利要求5所述超小型RNA碱基编辑器，其特征在于，将REPAIRv2单碱基编辑器或RESCUE-S RNA单碱基编辑器中的dCas13b的序列替换为权利要求2所述的基因，同时将REPAIRv2单碱基编辑器或RESCUE-S RNA单碱基编辑器中的核输出信号序列替换为核定位信号序列。
8.如权利要求5所述超小型RNA碱基编辑器的构建方法，其特征在于，将REPAIRv2单碱基编辑器或RESCUE-S RN
9.如权利要求5～7任一所述超小型RNA碱基编辑器在制备基因编辑编辑试剂中的应用。
10.一种非疾病诊断与治疗目的的基因编辑方法，其特征在于，通过权利要求5～7任一所述超小型RNA碱基编辑器进行基因编辑。
...【技术特征摘要】
1.一种cas13蛋白突变体，其特征在于，由野生型cas13蛋白突变得到，所述野生型cas13蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体突变为以下任意一种：
2.编码权利要求1所述cas13蛋白突变体的基因。
3.一种包含权利要求2所述基因的表达载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，还包括核定位信号，表达启动子为cmv启动子。
5.一种超小型rna碱基编辑器，其特征在于，包括权利要求2所述的基因。
6.如权利要求5所述超小型rna碱基编辑器，其特征在于，还包括核定位信号。
7.如权利要求5所述超小型rna碱基编辑器，其特征在于，将repairv2单碱基编辑器或rescue-s rna单碱基编辑器中的d...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚远，李果，程亚仙，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：
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