【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及污水检测的，具体为一种氨氧化菌及利用氨氧化菌检测废水毒性的方法。
技术介绍
1、绿色荧光蛋白(gfp)是一种理想的荧光标记物，被广泛应用于真核和原核生物基因表达。用于标记的绿色荧光蛋白分为野生型和突变体。其中，野生型由于蛋白合成和折叠都较慢，收到外界因素影响较大，从而限制了其应用；而突变体具有高折叠效率、蛋白合成速度，以及荧光强度都大大地增强了，且可以适应高温、强酸碱等极端环境；因此，突变体是荧光蛋白标记的首选。研究表明，gfp标记后的真核或原核生物的原有性能不会随着gfp的表达而改变，gfp荧光的激发不消耗生物能量，不需要任何底物或者辅助因子，且可通过荧光显微镜、荧光分光光度计等仪器对标记的微生物进行实时、原位的定量计算其荧光强度。
2、另一方面，工业污水处理过程中，常常存在水中氨氮超标的问题。究其原因，主要是活性污泥中氨氧化微生物失活或者死亡了，而导致氨氧化微生物失效的原因主要是污水中的毒性物质，如常见的皮革废水中的重金属铬、电路板废水中的有机物硫脲等，这些物质不会被实时监测，一旦累积会影响氨氧化微生物的活性，阻断氨氧化过程，进而导致出水中氨氮超标。
3、现有技术中，针对污水处理过程中常规指标比如氨氮超标的毒性检测还未见有研究，目前的研究主要是针对污水处理后或者是污水中某一类毒性物质的检测。如利用发光细菌检测城市污水中的毒性种类及综合毒性，但是该方法仅用于污水处理后的毒性评价，且对某些水质的检测结果不精确。还有利用小球藻检测污水的生物毒性，但是检测方法较为繁琐，且结果评价标准单一，仅对某
4、综上，人们需要一种氨氧化菌及利用氨氧化菌检测废水毒性的方法来解决上述问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种氨氧化菌及利用氨氧化菌检测废水毒性的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种氨氧化菌，所述氨氧化菌为假单胞菌pseudomonas，其16srdna序列如seqno.1所示。
4、进一步的，所述氨氧化菌的命名为假单胞菌pseudomonas sp.hz-004，保藏编号为cgmcc no.23464，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年9月22日；所述氨氧化菌可以用于降解氨氮。
5、其中，标记所用的绿色荧光蛋白(gfp)为超级折叠绿色荧光蛋白(sfgfp),这种gfp是经过野生型突变而来，荧光强度更高，稳定性好，无毒性，灵敏度也更高。
6、进一步的，一种氨氧化细菌的筛选方法，包括以下步骤：
7、步骤1：菌株富集：将市政污水处理厂生化池活性污泥在富集培养基中进行富集培养，得到异样硝化菌的富集液；
8、步骤2：菌株分离和纯化：采用稀释涂布平板法将富集液涂布于固体分离培养基上，分离纯化，得到的氨氧化菌。
9、进一步的，氨氧化细菌的筛选方法的详细过程为：
10、s1：菌株富集：取污水区的活性污泥在富集培养基中进行振荡培养，定时检测氨氮浓度，当氨氮浓度减少至80％以上，以1％的接种量在富集营养基中继续富集，循环3～4个周期，得到异样硝化菌的富集液；其中，振荡培养过程中，活性污泥与富集培养基基的比例为20g：200ml，温度为30℃，振荡速度为160r/min，定时检测的时间为24小时。
11、s2：菌株分离和纯化：采用稀释涂布平板法将富集液涂布于固体分离培养基上，每个平板取100μl富集液涂布，30℃恒温培养至菌落出现，于固体分离培养基上划线分离，重复2-3次划线分离，直至平板上形成均匀的菌落，得到的氨氧化菌；
12、s3：菌株鉴定：将氨氧化菌进行16s rdna鉴定，序列如seq.no1所示；并将其与genbank数据库中已知序列进行相似度对比，鉴定为假单胞菌pseudomonas，命名为hz-004。
13、其中，seq.no1：
14、
15、进一步的，步骤s1中，富集营养基的配方包括以下成分：0.4～0.6g(nh4)2so4，2.1～2.3gc4h4na2o4，0.4～0.6gmgso4·7h2o，0.35～0.45gk2hpo4，0.1～0.2gkh2po4，1.5～2.5ml微量元素溶液，补充蒸馏水至1l，ph＝7.0-7.2；微量元素溶液包括以下成分：48.0～52.0gedta，2～2.4gznso4，5.3～5.7gcacl2·2h2o，5.0～5.1gmncl2·4h2o，4.8～5.1gfeso4·7h2o，1.0～1.2g(nh4)6mo7o2·4h2o，1.52～1.60gcuso4·5h2o，1.60～1.62gcocl2·6h2o，补蒸馏水至1l，ph＝6.0-7.2。
16、进一步的，步骤s2中，固体分离培养基制备方法为：在分离液体培养基的基础上，加入1.5％-2％的琼脂，得到固体分离培养基；分离液体培养基的配方包括以下成分：0.48～0.52g(nh4)2so4，5.0～5.12gc4h4na2o4，48～52ml维氏盐溶液，补充蒸馏水至1l，ph＝7.0-7.2；维氏盐溶液包括以下成分：4.8～5.2gk2hpo4，2.3～2.6gmgso4·7h2o，2.3～2.7gnacl，0.04～0.06gfeso4·7h2o，0.04～0.06gmnso4·4h2o，加蒸馏水溶解并定容至1l。
17、进一步的，使用绿色荧光蛋白标记氨氧化菌。
18、进一步的，一种荧光标记氨氧化菌的构建方法，具体构建过程为：
19、(1)表达质粒的构建：pcr扩增sfgfp片段，将扩增后的sfgfp基因片段与载体plem415重组，得到重组质粒；将其经过热激法转化进入e.coil top10感受态细胞中，培养，得到plem415-sfgfp表达质粒；
20、具体过程为：所用载体质粒为plem415,根据质粒载体的序列设计了一对特异性的引物sfgfp-ndei和sfgfp-sali,这对引物可以扩增sfgfp基因全片段(片段共1006bp)以及启动子和终止子，同时在5’和3’端分别加入了ndei和sali作为限制性内切酶位点(横线即为酶切位点)。
21、sfgfp-ndei 5’cagagtcatatgggagcacatgca 3’(ndeⅰ)；
22、sfgfp-sali 5’cctggtcgactgtagagtctaatcc 3’(salⅰ)；
23、(2)氨氧化菌感受态细胞的制备：采用冰浴法制备氨氧化菌hz-004的感受态细胞，得到假单胞菌hz-004；
24、(3)表达质粒的转化：采用电击转化法将表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种氨氧化菌，其特征在于：所述氨氧化菌为假单胞菌Pseudomonas，其16SrDNA序列如Seq NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种氨氧化菌，其特征在于：所述氨氧化菌的命名为HZ-004，保藏编号为CGMCC NO.23464；所述氨氧化菌可以用于降解氨氮。
3.一种氨氧化细菌的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种氨氧化细菌的筛选方法，其特征在于：步骤S1中，富集营养基的配方包括以下成分：0.4～0.6g(NH4)2SO4，2.1～2.3gC4H4Na2O4，
5.根据权利要求3所述的一种氨氧化细菌的筛选方法，其特征在于：步骤S2中，固体分离培养基制备方法为：在分离液体培养基的基础上，加入1.5％-2％的琼脂，得到固体分离培养基；分离液体培养基的配方包括以下成分：0.48～0.52g(NH4)2SO4，
6.一种荧光标记氨氧化菌，其特征在于：使用绿色荧光蛋白标记权利要求1～5任一项所述的氨氧化菌。
7.一种根据权利要求6所述一种荧光标记氨氧化菌的构建方法，其特征
8.一种根据权利要求6所述的荧光标记氨氧化菌在废水毒性检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的荧光标记氨氧化菌在废水毒性检测中的应用，其特征在于：废水毒性检测前对荧光标记氨氧化菌进行活化，活化过程为：挑取荧光标记氨氧化菌的单菌落到分离培养基中，摇床培养，将获得的培养液全部转接到分离培养基中，摇床培养；得到菌株活化液。
10.根据权利要求8所述的荧光标记氨氧化菌在废水毒性检测中的应用，其特征在于：废水毒性检测时使用荧光传感检测装置，所述荧光传感检测装置包括外壳、激光光源(3)、第一滤光片(1)、第二滤光片(2)、光强检测器(4)、光强显示器(5)；第一滤光片(1)、第二滤光片(2)设置有比色皿，用于装载检测样品；
...【技术特征摘要】
1.一种氨氧化菌，其特征在于：所述氨氧化菌为假单胞菌pseudomonas，其16srdna序列如seq no.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种氨氧化菌，其特征在于：所述氨氧化菌的命名为hz-004，保藏编号为cgmcc no.23464；所述氨氧化菌可以用于降解氨氮。
3.一种氨氧化细菌的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种氨氧化细菌的筛选方法，其特征在于：步骤s1中，富集营养基的配方包括以下成分：0.4～0.6g(nh4)2so4，2.1～2.3gc4h4na2o4，
5.根据权利要求3所述的一种氨氧化细菌的筛选方法，其特征在于：步骤s2中，固体分离培养基制备方法为：在分离液体培养基的基础上，加入1.5％-2％的琼脂，得到固体分离培养基；分离液体培养基的配方包括以下成分：0.48～0.52g(nh4)2so4，
6.一种荧光标...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓敬轩，刘诚，向斯，单晓红，邱勋，
申请(专利权)人：恒臻无锡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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