【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因测序文库制备，涉及一种制备长基因片段的方法及其应用。
技术介绍
1、虽然第二代测序技术以高通量、经济性和多功能等特点推动了其在靶向测序，结构变异的表征及表观遗传修饰等研究领域的应用。但第二代测序技术难以检测复杂的结构变异，如大片段的倒位、缺失或易位等，然而这些变异通常与遗传疾病相关。以单分子测序为特征的第三代测序技术，建库过程不需要pcr扩增，可实现对单个dna或rna分子的测序，具有超长读长、低偏倚性等特点，广泛应用于全基因组de novo测序，全长转录本测序，结构变异检测及表观遗传学等研究领域，可获得第二代测序技术难以检测的基因详细信息，同时还可以直接进行甲基化分析，测序过程更加简便，结果更为准确。
2、然而，文库制备作为测序技术上游部分，文库本身的质量是制约测序结果准确性最重要的因素之一。尤其对于第三代测序，文库本身的长度是文库制备中挑战最大部分之一，因为要得到片段长度大于10kb的文库有很大困难，而片段长度主要由打断步骤决定。传统的打断方法应用到三代文库制备时无法获得长片段。目前，三代测序文库制备打断步骤中商业化工具主要有diagenode公司megaruptor设备匹配相关试剂和covaris公司配备专门g-tube管剪切基因组dna，这两种商业化设备及试剂均依赖于进口，成本极高。因此，面对测序方法的核心技术被国外公司掌握，三代测序文库制备技术在我国还处于严重落后状态的现状，寻找新型有效的dna打断方法是很有意义和挑战的。
技术实现思路
1、
2、本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：
3、一种制备长基因片段的方法，所述方法包括如下步骤：将基因组dna与打断耗材进行混合，然后进行超声空化打断得长基因片段。
4、在上述的一种制备长基因片段的方法中，打断耗材为氧化锆珠。
5、氧化锆珠的质地坚硬，其密度介于钨钢珠与玻璃珠之间，本专利技术利用氧化锆珠在超声碰撞过程中表现出极佳的运动状态获得长片段，本专利技术基于氧化锆珠的超声空化打断基因组获得长基因片段是氧化锆珠的机械碰撞作用与超声空化作用的综合结果。超声波在dna溶液中传播时，产生的空化效应可使dna断裂，本专利技术发现氧化锆珠在特定超声振动的驱动下产生机械碰撞，大大提高了dna打断效率，相比于常规打断方法，氧化锆珠和超声空化两者协同获得长基因片段的概率得到大幅度提升。
6、在上述的一种制备长基因片段的方法中，氧化锆珠粒径为0.02-10mm。
7、作为优选，氧化锆珠粒径为1-6mm。
8、在上述的一种制备长基因片段的方法中，基因组dna浓度为0.5-50ng/μl。
9、在上述的一种制备长基因片段的方法中，基因组dna的质量为5ng-5ug。
10、在上述的一种制备长基因片段的方法中，每100μl基因组dna加入打断耗材2-30个。
11、作为优选，当氧化锆珠粒径为0.5-2mm，每100μl基因组dna加入量为2-50个；
12、当氧化锆珠粒径为3-4mm，每100μl基因组dna加入量为2-30个；
13、当氧化锆珠粒径为5-8mm，每100μl基因组dna加入量为2-10个。
14、在上述的一种制备长基因片段的方法中，超声空化打断过程中超声探头的运行功率为50-400w。
15、在上述的一种制备长基因片段的方法中，超声空化打断时间为10-500s，打断循环次数为1-5。
16、本专利技术超声空化打断所得基因片段的长度有随着超声时间的增加而减小，可见本专利技术由氧化锆材料介导的超声空化打断基因组dna获得长基因片段的方法不仅能够得到长基因片段，还可通过调整超声空化时间控制基因片段的长度。
17、作为优选，每次循环打断时间为10-100s。
18、本专利技术发现长时间的超声空化不仅不能获得长片段，反而会降低打断效率，导致部分输入的基因组dna不能被完全打断。因此，当超声空化时间增长时，则需要通过增加循环次数来实现同等时间基因组dna被完全打断。
19、在上述的一种制备长基因片段的方法中，长基因片段均≥5000bp。
20、本专利技术还提供了一种上述长基因片段在长读长基因测序技术中的应用，长读长测序平台包括pacbio和nanopore中的一种。
21、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术一种由氧化锆材料介导的超声空化打断基因组dna获得长基因片段的方法，首先选择了具有高硬度和化学惰性的氧化锆基质作为打断耗材，并结合驻波悬浮式高能超声探头设备作为基因片段化的动力来源，大大降低了文库片段化成本；并通过选择氧化锆材料的形状、大小、数目以及驻波悬浮式高能超声探头的运行条件可得到长基因片段(≥5000bp)，尤其是≥10000bp的片段，适用于单分子测序文库制备中的基因组打断。
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1.一种制备长基因片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将基因组DNA与打断耗材进行混合，然后进行超声空化打断得长基因片段。
2.根据权利要求1所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，打断耗材为氧化锆珠。
3.根据权利要求2所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，氧化锆珠粒径为0.02-10mm。
4.根据权利要求1所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，基因组DNA浓度为0.5-50ng/μl。
5.根据权利要求1所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，基因组DNA的质量为5ng-5ug。
6.根据权利要求1所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，每100μl基因组DNA加入打断耗材2-30个。
7.根据权利要求1所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，超声空化打断过程中超声探头的运行功率为50-400W。
8.根据权利要求1所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，超声空化打断时间为10-500s,打断循环次数为1-5。
9.根据权利要求1所述的一
10.一种如权利要求1所述长基因片段在长读长基因测序技术中的应用，其特征在于，长读长测序平台包括PacBio和Nanopore中的一种。
...【技术特征摘要】
1.一种制备长基因片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将基因组dna与打断耗材进行混合，然后进行超声空化打断得长基因片段。
2.根据权利要求1所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，打断耗材为氧化锆珠。
3.根据权利要求2所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，氧化锆珠粒径为0.02-10mm。
4.根据权利要求1所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，基因组dna浓度为0.5-50ng/μl。
5.根据权利要求1所述的一种制备长基因片段的方法，其特征在于，基因组dna的质量为5ng-5ug。
6.根据权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑建萍，赵桃娃，马剑威，白冰，瞿洋，孔同，丁乔姣，
申请(专利权)人：宁波慈溪生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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