System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 一种水稻分蘖调控基因、突变体及其制备方法和应用技术_技高网

一种水稻分蘖调控基因、突变体及其制备方法和应用技术

技术编号:40158134 阅读:6 留言:0更新日期:2024-01-26 23:33
本发明专利技术公开了一种水稻分蘖调控基因、突变体及其制备方法和应用,所述水稻分蘖调控基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术使用基因编辑技术特异敲除OsCKX3基因,通过降低OsCKX3表达或OsCKX3功能完全缺失进而增加水稻分蘖数、提高水稻穗粒数和提高水稻产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程,具体涉及一种水稻分蘖调控基因、突变体及其制备方法和应用


技术介绍

1、随着世界人口的不断增加,人们对粮食的需求也不断增加,水稻作为主要的粮食作物,是世界近一半人口赖以为生的主食。水稻的产量和品质也越来越成为人们关注的焦点,水稻的产量主要是由分蘖、穗粒以及粒重所决定的。因此,研究水稻的分蘖数相关控制基因对提高水稻产量起到至关重要的作用。

2、细胞分裂素是植物特异性激素,参与植物生长发育的重要过程,是贯穿植物一生的重要信号分子。在植物体中,主要包括异戊烯腺嘌呤(isopentenyladenine,ip)、反式玉米素(trans-zeatin,tz)、顺式玉米素(cis-zeatin,cz)和二氢玉米素(dihydrozeatin,dhz)在内的几种植物中天然存在的细胞分裂素。细胞分裂素参与植物胚胎发育、根系生长、延缓衰老以及刺激植物顶端优势等方面。

3、细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(cytokinin oxidase/dehydrogenase,ckx)是植物细胞内重要的细胞分裂素降解酶,且该降解过程是不可逆的。细胞分裂素氧化酶ckx通过降解细胞分裂素ck侧链的不饱和异戊二烯,生成腺嘌呤和对应的醛,从而使细胞分裂素失去活性。目前在拟南芥中鉴定出7个atckx(atckx1-7)。ckx酶由fad功能域和底物的结构域组成。虽然是fad和底物结构域在各种ckx酶中都是保守的,但是这些保守区域以外的序列显示出一个很强的序列差异。拟南芥中ckx酶的生化特性和亚细胞定位也有所不同。

<p>4、基于数据分析,目前在水稻基因组中鉴定到了11个 osckx成员,目前已经报道了7个家族成员,研究发现,敲除或者降低 osckx2的表达量,会使细胞分裂素在水稻顶端分生组织积累,增加花粉管的数量,同时分蘖数和穗粒数与野生型相比都有明显的增加,从而使水稻的产量有明显的增加。 osckx3基因报导参与地上部分支角度的调控,另外研究发现, osckx4参与水稻不定根的发育, osckx4主要表达在叶片和根中,在不定根原基中优先表达,过表达和rnai会对不定根的形成起到促进作用,另外酵母单杂实验表明, osckx4能够直接被osarf25和细胞分裂素反应因子osrr2和osrr3直接结合,说明 osckx4能够通过细胞分裂素和生长素途径来调控水稻不定根发育。已有文献报道, osckx9参与激活独角金内酯驱动细胞分裂素的降解过程, osckx9作为一个主要的独角金内酯响应基因。另外,通过定点突变水稻细胞分裂素氧化酶编码基因 osckx11,分析其突变体表型变化发现,该基因功能缺失会使水稻叶片晚衰。

5、水稻分蘖是对提高水稻产量的重要的指标,现阶段,通过基因编辑技术来提高水稻分蘖数量进而达到增产效果的研究明显不足。


技术实现思路

1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种水稻分蘖调控基因、突变体及其制备方法和应用,使用基因编辑技术特异敲除 osckx3基因,通过使 osckx3功能完全缺失进而增加水稻分蘖数、提高水稻穗粒数和提高水稻产量。

2、本专利技术提供了如下的技术方案:

3、第一方面,提供一种水稻分蘖调控基因,所述基因的核苷酸序列如seq id no.1或者seq id no.2所示。

4、第二方面,提供一种水稻分蘖调控突变体,包括具有核苷酸序列如seq id no.1或者seq id no.2所示的基因。

5、第三方面,提供一种水稻分蘖调控突变体的制备方法,包括:对水稻基因 osckx3的核苷酸序列进行靶向编辑,获得具有核苷酸序列如seq idno.1或者seq id no.2所示基因的突变体。

6、进一步的,包括以下步骤:

7、在 osckx3基因上选择靶点并设计引物;

8、将引物连接sgrna表达盒,然后进行扩增,得到靶标grna表达盒;

9、将靶标grna表达盒与pylcrispr/cas9-mh(b) 连接,得到 osckx3基因敲除载体;

10、将 osckx3基因敲除载体转化农杆菌,并侵染水稻成熟愈伤组织,然后进行抗性筛选,得到抗性愈伤组织;

11、对抗性愈伤组织进行分化成苗,得到水稻分蘖调控突变体水稻幼苗。

12、进一步的,在 osckx3基因上选择靶点,根据启动子设计引物;

13、所述启动子为u6a和u6b;

14、所述引物为核苷酸序列如seq id no.3所示的osckx3-t1-f、核苷酸序列如seq idno.4所示的osckx3-t1-r、核苷酸序列如seq id no.5所示的osckx3-t2-f、核苷酸序列如seq id no.6所示的osckx3-t2-r。

15、进一步的,所述将引物连接sgrna表达盒的方法包括:

16、取质粒pylgrna-osu6a/lacz和pylgrna-osu6b进行酶切,将酶切后的质粒与引物对应接头进行连接。

17、进一步的,连接引物后的sgrna表达盒进行扩增的方法包括:

18、98℃预变性5min,98℃变性30s,55℃退火15s,58℃延伸30s,循环30次,68℃延伸5min,得到扩增的pcr产物;

19、扩增的pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后使用凝胶回收试剂盒进行切胶回收,得到回收片段,即靶标grna表达盒。

20、进一步的,将靶标grna表达盒与pylcrispr/cas9-mh(b) 连接的方法包括:

21、选取bsaⅰ内切酶和t4连接酶边切边连,将靶标grna表达盒连接到含有卡那霉素抗性的表达载体pylcrispr/cas9-mh(b)上。

22、进一步的,还包括对水稻分蘖调控突变体水稻幼苗进行t0代转基因植株的筛选和鉴定:

23、提取t0代转基因植株dna,鉴定cas9,得到含有cas9的t0代转基因植株种;

24、将含有cas9的t0代转基因植株种在地里进行繁种,收获t1代进行基因型鉴定,在靶点上下游500bp进行设计引物,然后扩增目标序列;

25、扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳,验证条本文档来自技高网...

【技术保护点】

1. 一种水稻分蘖调控基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示。

2. 一种水稻分蘖调控突变体,其特征在于,包括具有核苷酸序列如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示的基因。

3. 一种水稻分蘖调控突变体的制备方法,其特征在于,包括:对水稻基因OsCKX3的核苷酸序列进行靶向编辑,获得具有核苷酸序列如SEQ IDNO.1或者SEQ ID NO.2所示基因的突变体。

4.根据权利要求3所述的水稻分蘖调控突变体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

5.根据权利要求4所述的水稻分蘖调控突变体的制备方法,其特征在于,在OsCKX3基因上选择靶点,根据启动子设计引物;

6.根据权利要求4所述的水稻分蘖调控突变体的制备方法,其特征在于,所述将引物连接sgRNA表达盒的方法包括:

7.根据权利要求4所述的水稻分蘖调控突变体的制备方法,其特征在于,连接引物后的sgRNA表达盒进行扩增的方法包括:

8. 根据权利要求4所述的水稻分蘖调控突变体的制备方法,其特征在于,将靶标gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH(B) 连接的方法包括:

9.根据权利要求4所述的水稻分蘖调控突变体的制备方法,其特征在于,还包括对水稻分蘖调控突变体水稻幼苗进行T0代转基因植株的筛选和鉴定:

10.一种权利要求1所述水稻分蘖调控基因,或权利要求2所述水稻分蘖调控突变体,或权利要求3~9任一项所述方法制备的突变体在调控水稻分蘖中的应用。

...

【技术特征摘要】

1. 一种水稻分蘖调控基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列如seq id no.1或者seq id no.2所示。

2. 一种水稻分蘖调控突变体,其特征在于,包括具有核苷酸序列如seq id no.1或者seq id no.2所示的基因。

3. 一种水稻分蘖调控突变体的制备方法,其特征在于,包括:对水稻基因osckx3的核苷酸序列进行靶向编辑,获得具有核苷酸序列如seq idno.1或者seq id no.2所示基因的突变体。

4.根据权利要求3所述的水稻分蘖调控突变体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

5.根据权利要求4所述的水稻分蘖调控突变体的制备方法,其特征在于,在osckx3基因上选择靶点,根据启动子设计引物;

6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员:宣伟李论骆乐徐国华
申请(专利权)人:南京农业大学三亚研究院
类型:发明
国别省市:

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