【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种猫肾crfk贴壁细胞系的建立及悬浮驯化与应用。
技术介绍
1、随着宠物行业的不断发展，宠物饲养数量逐年增多，以宠物猫和宠物狗为主，在宠物带给人们快乐的同时，宠物健康问题也威胁着公共安全。目前国内动物疫苗企业商品化的宠物疫苗不多，质量参差不齐，主要依赖进口，产品价格昂贵，国内很多单位正着手这一领域产品的开发。目前危害宠物猫的病毒主要有猫细小病毒，犬细小病毒，猫冠状病毒，猫疱疹病毒等，而对宠物猫产生严重危害的病毒就是猫细小病毒。
2、传统的crfk细胞培养多采用有血清贴壁培养方式。血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其他营养物质，可有效地促进细胞生长和产物表达。然而，血清的应用也存在许多问题：易受病毒、支原体或其他病原体的污染；批间差异造成产品批次间的质量难以严格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分离纯化的难度，部分蛋白难以通过分离纯化手段彻底去除，影响了产品的最终质量；此外，血清来源困难、价格昂贵，大规模动物细胞培养过程中使用血清会增加生产成本。crfk和f81均属于上皮样猫肾细胞系。crfk最早在1964年由crandell分离，f81是由crfk通过传代克隆筛选转化而来的工程细胞系。两种细胞均易于贴壁培养，对多种宠物病毒和特产经济动物病毒较敏感，在兽医生物制品研究中得到了广泛应用。如犬细小病毒(cpv)、猫泛白细胞减少症病毒(fpv)、猫疱疹病毒(fhv)、猫杯状病毒(fcv)、水貂病毒性肠炎病毒(mev
3、鉴于猫病毒性抗原(如fpv、fhv、fcv)在常规crfk和f81细胞系上敏感性不一致，无法用单一细胞系生产多联宠物疫苗。为方便实验室研究和工艺开发，进行猫肾原代细胞的分离与传代细胞系的建系研究；分选出对宠物病毒敏感性更强的crfk细胞系。crfk细胞的培养方法基本采用二维单细胞层贴壁培养。在单细胞层培养体系中，细胞增殖易受到基质表面积的限制，难以实现大规模生产，且消化过程亦会增加工艺的复杂性、生产时间和成本。而单细胞悬浮培养可以不受细胞生长表面的限制，易于实现细胞及产品的大规模生产。有关crfk细胞培养方式、代谢特征和培养过程的研究工作不多。因此，crfk细胞无血清单细胞悬浮培养系统的开发与研究对其产业化进程意义重大。
技术实现思路
1、为了解决上述技术难题，本研究选取10日龄无特异性病原体幼猫肾脏，经消化研磨后于含10％胎牛血清的dmem培养基进行培养，经连续筛选和传代验证细胞传代稳定性，经外源病毒、支原体检验后建立crfk细胞系种子库。结果表明，分离的猫肾原代细胞经连续10代筛选培养后，细胞形态基本一致；连续传代至45代，细胞形态单一且生长速率稳定、外源病毒及支原体检验合格；成功建立猫肾细胞传代细胞系，命名为crfk，呈上皮细胞样，属自发永生细胞系。而且在此基础上，利用无血清培养基中成功进行了无血清驯化，并通过单细胞悬浮培养驯化方法，获得了适合无血清单细胞悬浮培养的crfk-s细胞株。为crfk细胞培养、病毒疫苗扩增的过程优化和放大奠定了基础，同时也为其他动物细胞培养过程和疫苗等生物制品的工业化生产提供借鉴。
2、具体的本专利技术提供一种猫肾细胞系，命名为crfk-bla，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no：45703，分类命名为：猫肾细胞，保藏日期为：2023年8月17日。
3、进一步的，本专利技术提供一种crfk细胞的无血清驯化方法，包括如下步骤；
4、crfk细胞准备将复苏的crfk细胞(crfk-bla保藏株)接种到含8％胎牛血清的dmem培养基中，按照常规方法传代培养5代；
5、crfk细胞梯度降血清培养将上述所获得的贴壁培养型crfk细胞依次用含6％、4％、2％胎牛血清的dmem培养基各培养6代，按1∶3比例进行传代培养，于37℃、含5％co2细胞培养箱中培养；
6、低血清全悬浮培养基crfk细胞贴壁培养用含2％胎牛血清的全悬浮培养基，将上步骤中最后一代所获得的细胞进行贴壁培养；待细胞贴壁、培养瓶中单层汇合度达90％以上后，弃去培养液；用0.125％ edta-胰酶消化分散，按1∶2比例进行传代培养，于37℃、含5％co2细胞培养箱中培养。连续传代培养5代，得到适应全悬浮培养基低血清贴壁培养型crfk细胞系。
7、低血清全悬浮培养基crfk细胞悬浮培养用含2％胎牛血清的全悬浮培养基将上步骤中最后一代所获细胞密度调整至1×106cells/ml，于37℃、含5％co2，120r/min摇床培养；待细胞密度达到4×106cells/ml时，用含1％胎牛血清的全悬浮培养基按1∶4比例分瓶培养；待细胞密度达到4×106cells/ml时，用含0.5％胎牛血清的全悬浮培养基按1∶3比例分瓶培养；连续传代五次后，驯化得到低血清全悬浮培养型crfk细胞系，于37℃、含5％co2，120r/min摇床培养，驯化得到低血清全悬浮培养型crfk细胞系。
8、进一步的，本专利技术提供一种crfk单细胞悬浮无血清驯化方法，所述方法包括步骤：
9、96孔板筛选单细胞将低血清全悬浮培养型crfk细胞系，离心后加入无血清全悬浮培养基，吹打悬浮细胞并计数，将细胞用无血清全悬浮培养基稀释，制成10cells/ml的细胞悬液，按100μl/孔加入96孔细胞培养板，于37℃、含5％co2细胞培养箱中培养。
10、24孔板筛选单细胞培养48～72小时后，从96孔细胞培养板中选数个仅有1个细胞/孔的培养孔，挑选出生长良好的单细胞株；将其转移至24孔板，于37℃、含5％co2细胞培养箱中培养。
11、6孔板筛选单细胞培养48～72小时后，从24孔细胞培养板中挑选出生长良好的单细胞株；将其转移至6孔板，于37℃、含5％co2细胞培养箱中培养。
12、单细胞贴壁放大培养培养48～72小时后，从6孔细胞培养板中挑选出生长良好的单细胞株；将其转移至25cm2培养瓶，于37℃、含5％co2细胞培养箱中培养。
13、单细胞悬浮培养待细胞生长至90％时，按上述方法消化后，转移至摇瓶继续培养。调整细胞密度为5×105cells/ml，于37℃、含5％co2，120r/min摇床培养，驯化得到无血清全悬浮培养型crfk细胞系。
14、进一步的，本专利技术提供一种无血清全悬浮培养型crfk细胞系，命名为crfk-bls，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no：45704，分类命名为：猫肾悬浮细胞，保藏日期为：2023年8月17日。
15、进一步的，本专利技术提供一种上述猫肾细胞系和/或无血清全悬浮培养型crfk细胞系在(1)～(8)中任一项中的应用；
16、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猫肾细胞系，其特征在于所述猫肾细胞系命名为CRFK-BLA，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO：45703，分类命名为：猫肾细胞，保藏日期为：2023年8月17日。
2.一种CRFK细胞的无血清驯化方法，其特征在于所述方法包括如下步骤；
3.一种CRFK单细胞悬浮无血清驯化方法，其特征在于所述方法包括步骤：
4.一种无血清全悬浮培养型CRFK细胞系，其特征在于所述无血清全悬浮培养型CRFK细胞系命名为CRFK-BLS，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO：45704，分类命名为：猫肾悬浮细胞，保藏日期为：2023年8月17日。
5.一种权利要求1所述猫肾细胞系和/或权利要求4所述无血清全悬浮培养型CRFK细胞系在在(1)～(8)中任一项中的应用；
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述病毒为犬细小病毒、猫泛白细胞减
7.利用权利要求1所述猫肾细胞系和/或权利要求4所述无血清全悬浮培养型CRFK细胞系培养病毒疫苗的方法。
...【技术特征摘要】
1.一种猫肾细胞系，其特征在于所述猫肾细胞系命名为crfk-bla，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no：45703，分类命名为：猫肾细胞，保藏日期为：2023年8月17日。
2.一种crfk细胞的无血清驯化方法，其特征在于所述方法包括如下步骤；
3.一种crfk单细胞悬浮无血清驯化方法，其特征在于所述方法包括步骤：
4.一种无血清全悬浮培养型crfk细胞系，其特征在于所述无血清全悬浮培养型crfk细胞系命名为crfk-bls，保藏在中国微生物菌种...
【专利技术属性】
技术研发人员：石文达，张中华，司永芳，赵晓，董昊，纪志辉，刘继红，王宏伟，
申请(专利权)人：泰州博莱得利生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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