一种猫犬白细胞介素11（IL-11）在毕赤酵母中的高效表达方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种猫/犬白细胞介素11(IL

【技术实现步骤摘要】
一种猫犬白细胞介素11（IL
‑
11）在毕赤酵母中的高效表达方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种全新编码的猫/犬白细胞介素11，及其核苷酸序列，以及在毕赤酵母中的高效表达方法。

技术介绍

[0002]Paul等人(1990)鉴定并克隆了一种新的基质细胞衍生的淋巴细胞生成和造血细胞因子的基因，被称为白细胞介素
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11。McKinley等人(1992)确定IL
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11的基因组序列长7kb，由5 个外显子和4个内含子组成。Yang
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Feng等人(1991)通过原位杂交证实IL
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11的cDNA定位于 19q13.3
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q13.4。
[0003]用基因预测法Gnomon对一个基因组序列(NC_018737.3)进行分析，得到猫IL
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11的 DNA序列和氨基酸序列，其前体蛋白由199个氨基酸组成，其中前21个氨基酸是信号肽，成熟蛋白由178个氨基酸组成，分子质量约21.3kDa，等电点pI为11.3。经过序列比对发现，猫IL
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11与犬IL
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11成熟蛋白的氨基酸序列完全相同，故基于此蛋白序列所表达的重组蛋白可用于猫和犬。
[0004]现有技术中已经证明IL
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11具有以下几种重要的生物学作用
[0005](1)对于造血系统的作用。IL
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11为重要的造血调节因子，对造血系统具有以下作用。第一，促进造血干细胞的生长和分化：与IL
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3、IL
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4、IL
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7和粒细胞刺激因子 (Granular
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cell stimulating factor，GSF)等协同作用于干细胞，缩短细胞周期，促进干细胞的扩增，并与造血微环境中其他细胞因子一起促进干细胞分化。第二，促进巨核细胞及血小板生成：IL
‑
11与IL
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3等干细胞生长因子(Stem cell factor，SCF)协同作用对巨核细胞系、红细胞系、粒细胞系和血小板生成的不同阶段都有刺激作用。IL
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11对巨核祖细胞增殖、成熟和分化均有作用，与IL
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3等细胞因子协同作用可缩短早期造血祖细胞G0期，使骨髓巨核系集落体积增大、数量增多，同时巨核细胞高倍体也增多。第三，促进淋巴细胞生成：SCF，IL
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4 共同作用可促进B淋巴细胞生成，该过程可能手T细胞的调节，且IL
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11、IL
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4在体外可以逆转IL
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3对早期B淋巴细胞产生过程中的抑制作用，故可诱导体液免疫。第四，IL
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11对骨髓纤维母细胞的生长等亦有调节作用，已被用于减轻肿瘤化疗药物的骨髓抑制副反应，临床显示IL
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11能显著减少造血功能受抑制肿瘤患者的血小板输注率，缩短血小板的恢复时间。
[0006](2)对于上皮细胞的作用。上皮细胞对辐射较敏感，其存活和再生最终影响机体的存亡，故保护上皮细胞是抗辐射损伤的重要方面，在呼吸道合胞病毒感染时肺泡及支气管上皮细胞合成大量的IL
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11，说明其参与了肺部炎症。有人认为IL
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11对干细胞的保护作用可能与其抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子，IL
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1、IL
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12防止上皮细胞凋亡有关。在体外，IL
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11可延迟肠上皮细胞进入S期，同时抑制Rb蛋白磷酸化，诱导肠上皮细胞缩短生长停滞，从而起到保护上皮细胞的作用。
[0007](3)对于免疫系统的作用。IL
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11可诱导体液免疫，刺激浆细胞增殖和分化，对骨髓
纤维母细胞的生长等亦有调节作用。同时，IL
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11具有多种活性，它可诱导急性期反应物的产生，能抑制脂肪形成及调节细胞外基质的代谢等。
[0008](4)IL
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11亚家族的细胞因子参与了骨细胞增殖和分化的调控。Takuchi等人(2002)报告 IL
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11对成骨细胞和骨形成有正面作用。在转基因小鼠中，人IL
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11基因的过表达可刺激骨形成，增加长骨皮质厚度和强度。
[0009]此外，IL
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11的生物学作用广泛，除对细胞和组织有保护作用外，尚能抑制肥胖、调节神经元分化，刺激金属蛋白酶抑制因子的产生和激活，可抑制细胞组织产生巨噬细胞肿瘤坏死因子，还具有一定的抗炎作用。Schafer等人(2017)的研究表明IL
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11在纤维化中起着重要作用。
[0010]而IL
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11的临床作用一般包括：
[0011](1)肿瘤化疗后血小板减少症。化疗常会引起骨髓抑制，使白细胞和血小板下降，尤其是后者，严重时会引起出血而被迫终止化疗，影响系统化疗的连续性和完整性。IL
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11具有升高血小板的功能。Saitoh等观察了单用IL
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11及其联用3种抗癌药物时对肺癌细胞增殖的影响，结果发现IL
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11可成功防止血小板减少而不改变化疗药物的抗癌活性。Reynolds的一个多中心、随机Ⅲ期临床实验也证实，IL
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11可有效防止化疗后血小板减少，有效减少血小板输注量，并保证化疗可连续进行不需调整剂量。IL
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11对肝硬化导致的血小板减少症同样有效。
[0012](2)前期再生障碍性贫血的血小板减少。随着免疫再生障碍性贫血的治疗取得了较满意的疗效。而前期再生障碍性贫血仅表现为一系或两系血细胞减少，伴均一性巨核细胞减少，因而血小板减少，增加了出血的危险。商安芳等选用IL
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11治疗再生障碍性贫血并发血小板减少患者6例，结果显效3例，良好1例，进步1例，无效1例，有效率为83.3％，效果良好。
[0013](3)与肾上腺皮质激素合用于特发性血小板减少性紫癜 (Thrombocytopenic idiopathic purpura，TIP)。TIP是因免疫机制使血小板破坏增多的临床综合症，发病机理尚未完全阐明，目前肾上腺皮质激素仍是首选治疗药物，但起效较慢。
[0014]另外，对于慢性肝病，IL
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11可以提高早期肝病患者的血小板计数，有利于治疗肝病时引起的血小板减少；IL
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11对肠黏膜损伤也具有保护作用，能有效地促进肠上皮细胞增殖，降低肠源性感染，对放化疗引起的肠上皮细胞凋亡具有明显的抑制作用，从而加速肠黏膜损伤再生修复的进程；对于乳腺癌及其他肿瘤患者，IL
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11可以安全地减轻放化疗引起的血小板减少症，保证放化疗顺利进行。它是目前全世界唯一己用于临床的促血小板生成药。其它适应症如肿瘤化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫/犬IL
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11重组核苷酸序列，其特征在于：所述猫/犬IL
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11重组核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。2.一种猫/犬IL
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11，其特征在于：该猫/犬IL
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11是由权利要求1所述猫/犬IL
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11重组核苷酸序列编码获得；优选地，所述猫/犬IL
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11包含如下氨基酸序列或与其具有85％以上同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。3.一种载体，其特征在于：所述载体含有权利要求1中编码该猫/犬IL
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11的DNA序列。4.一种工程细胞，其特征在于：所述工程细胞含有权利要求3所述的载体。5.一种重组猫/犬IL
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11在毕赤酵母中的高效表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将编码猫/犬IL
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11的DNA序列和毕赤酵母表达载体pPIC9K分别用SnaB I和Not I酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收，经T4 DNA连接酶连接过夜，次日用连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布至含有Amp的LB平板上，37℃培养过夜；次日，从平板上挑取单菌落，扩增后提取重组质粒；其中，编码猫/犬IL
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11的DNA序列如SEQ ID NO：3所示；(2)将携带重组质粒pPIC9K
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IL
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11的大肠杆菌接种于培养基中，37℃培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用NanoDrop定量后，用Sal I酶切过夜，用DNA提取试剂盒回收，得到线性化的pPIC9K
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IL
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11质粒，
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20℃保存备用；(3)取线性化的pPIC9K
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IL
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11质粒，用电转仪转化GS115感受态...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘继红，石文达，董昊，王金明，纪志辉，刘方，王宏伟，
申请(专利权)人：泰州博莱得利生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：