犬纤维蛋白原的制备方法及其产品技术

本发明专利技术的犬纤维蛋白原的生产方法，采用了从低温乙醇组份I提取、分离犬纤维蛋白原的方法，生产中采用的S/D法和水浴热处理法双重病毒灭活，能有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，确保了制品安全；提取出的产品纯度高达90％以上，杂质蛋白含量低，产品的临床副反应小。本发明专利技术具有如下优点：1、本发明专利技术所提供的制造方法，提取效率高。2、本发明专利技术所用冻干稳定剂，使产品在冻干过程中温度变化稳定，冻干后产品的结构均一，保证了犬纤维蛋白原的稳定性，起到保护纤维蛋白原的生物学活性的作用；3、在本发明专利技术的工艺过程中，纤维蛋白原的工艺复溶时间缩短为10分钟左右，为临床上宠物生命的抢救赢得了宝贵的时间。

【技术实现步骤摘要】
犬纤维蛋白原的制备方法及其产品
本专利技术涉及犬血液制品领域，特别涉及一种犬纤维蛋白原的制备方法。
技术介绍
纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)是血浆中的蛋白成分，含量高达2～4g/L,在犬凝血系统中发挥着关键作用，凝血的最后阶段是Fg在凝血酶的作用下转变为纤维蛋白，纤维蛋白和其他血细胞成分聚集成不溶性团状物达到止血的目的。Fg除直接参与凝血过程外，还在血小板聚集，血液粘度方面起着重要作用，是心、脑血管病发病的重要原因。Fg缺乏常见的相关疾病包括:先天性纤维蛋白原减少或缺乏症，由于肝损伤严重、肝硬化、弥散性血管内凝血、外伤、产后大出血、大手术、内出血等导致的获得性纤维蛋白原缺少症。由于先天因素引起的减少或缺乏症，补充Fg是目前唯一可靠的治疗方法，而对于后天不同因素引起的减少或缺乏症，根据病因的不同，也需要输注不同剂量的Fg制剂。目前，提取纤原的原料主要包括低温乙醇工艺产生的组分工(FI)沉淀和血浆冷沉淀两种。国内外大多数血液制品厂家基本以FI沉淀作为提取纤原的原料。F1沉淀主要含纤维蛋白原、FⅧ、纤维结合蛋白Fn等成分。冷沉淀是新鲜冰冻血浆(Freshfrozenplasma，FFP)在低温解冻后产生的白色絮状沉淀，其中含丰富的FⅧ，vonWillehrand因子、纤维蛋白原、纤维结合蛋白及XIII因子。同时冷沉淀也是制备FⅧ的主要起始原料，目前，已有报道从冷沉淀同时提取FⅧ和纤维蛋白原的工艺。在人医领域，纤维蛋白原及其复合制剂已经被广泛使用，但目前还没有一款纤维蛋白原制剂应用于宠物领域，我公司生产的犬纤维蛋白原，是以低温乙醇F1沉淀为原料，通过抽提、吸附、离心等制造工艺，并采用国际上先进的离子交换层析技术进行提纯，使得产品的纯度得到了很大的提高，为宠物疾病如：1.先天性纤维蛋白原减少或缺乏症。2.获得性纤维蛋白原减少症:严重肝脏损伤；肝硬化；弥散性血管内凝血；产后大出血和因大手术﹑外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍等提供了有效的诊疗手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生产过程中溶解速度快，生产周期短，使用时复溶快，生物学活性好，且收率高的纤维蛋白原的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种纤维蛋白原的制备方法，依次包括以下几个步骤：一种犬纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，步骤为：(1)将检验合格的犬血浆融化，搅拌使血浆完全溶解，调节血浆温度到-4～0℃，将其pH值调节到6.4～7.4，加入预冷乙醇至终浓度8％～10％(g/100ml)，保持在-4～0℃，13000-18000rpm离心保留沉淀；(2)上述沉淀加入8～10倍量的溶解液溶解，用连续离心机(保持在-4～0℃，13000-18000rpm)离心取上清；(3)所得的上清液中添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40～100rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6～8小时；(4)层析：用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的犬纤维蛋白原洗涤出来一并收集；(5)在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸/氯化钠，终浓度甘氨酸为0.9～1.5mol/L；氯化钠为1.5～2.5mol/L。待甘氨酸/氯化钠充分溶解完全后，将溶液冷却至0～10℃，用离心机对其以2000～5000rmp的速度进行连续离心分离；(6)用溶解液溶解步骤(5)所得的沉淀，搅拌2～6小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0～3.0％，并用0.5M盐酸溶液或0.5M氢氧化钠溶液将产品的pH值调节到6.4～7.4；(7)除菌过滤：用灭菌好的过滤器对步骤(6)所得的液体进行除菌过滤；(8)向步骤(7)得到的二次溶解清液中加入冻干保护剂，冻干，得到纤维蛋白原冻干制品。(9)热处理：将步骤(8)所得的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理。本专利技术所述的犬纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(1)中在0～4℃的条件下进行离心。本专利技术所述的犬纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤(1)中用0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液将溶解液的PH值调节为6.4～7.4。本专利技术所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述冷乙醇的浓度为50％～95％v/v。本专利技术所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的冻干保护剂为甘露醇和右旋糖苷-40葡萄糖注射液按照特定的用量配比组成，其中，甘露醇的浓度为4％～15％w/v，右旋糖苷-40葡萄糖注射液的浓度3％～8％w/v。本专利技术所述的纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，所述的溶解液缓冲液含有1.5～2.0g/L柠檬酸钠、6.0～8.0g/L氯化钠和8.0～10.0g/L甘氨酸。本专利技术所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。本专利技术的优点：1、本专利技术的犬纤维蛋白原的生产方法，采用了从组份I提取、分离犬纤维蛋白原的方法，生产中采用的S/D法和水浴热处理法双重病毒灭活，能有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，确保了制品安全；提取出的产品纯度高达90％以上，杂质蛋白含量低，产品的临床副反应小。2、本专利技术的犬纤维蛋白原，生产过程中采用甘露醇和右旋糖苷-40葡萄糖注射液作为稳定剂，使得产品在冻干过程中温度变化稳定，冻干后产品的结构均一，保证了犬纤维蛋白原的稳定性。3、在本专利技术的工艺过程中，纤维蛋白原的工艺复溶时间由一般工艺的2小时(37℃左右水浴)，缩短为10分钟左右(37℃左右水浴)。工艺复溶时间的缩短，降低了工艺制备过程中细菌繁殖的可能性，从而降低了产品中的热原，并且为临床上宠物生命的抢救赢得了宝贵的时间；具体实施方式以下结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1犬纤维蛋白原制剂的制备1、制备方法(1)将检验合格的犬血浆100L溶解，搅拌使血浆完全溶解，调节血浆温度到0℃，将其pH值调节到6.4，加入预冷乙醇至终浓度10％(g/100ml)，离心保留沉淀；(2)上述沉淀加入8倍量的溶解液溶解，用连续离心机离心取上清；(3)所得的上清液中添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6小时；(4)层析：用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，步骤为：/n(1)将检验合格的犬血浆融化，搅拌使血浆完全溶解，调节血浆温度到-4～0℃，将其pH值调节到6.4～7.4，加入预冷乙醇至终浓度8％～10％(g/100ml)，离心保留沉淀；/n(2)上述沉淀加入8～10倍量的溶解液溶解，用连续离心机离心取上清；/n(3)所得的上清液中添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40～100rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6～8小时；/n(4)层析：用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的犬纤维蛋白原洗涤出来一并收集；/n(5)在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸/氯化钠，终浓度甘氨酸为0.9～1.5mol/L；氯化钠为1.5～2.5mol/L。待甘氨酸/氯化钠充分溶解完全后，将溶液冷却至0～10℃，用离心机对其以2000～5000rmp的速度进行连续离心分离；/n(6)用溶解液溶解步骤(5)所得的沉淀，搅拌2～6小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0～3.0％，并用0.5M盐酸溶液或0.5M氢氧化钠溶液将产品的pH值调节到6.4～7.4；/n(7)除菌过滤：用灭菌好的过滤器对步骤(6)所得的液体进行除菌过滤；/n(8)向步骤(7)得到的二次溶解清液中加入冻干保护剂，冻干，得到纤维蛋白原冻干制品。/n(9)热处理：将步骤(8)所得的产品，进行100℃±2℃，30分钟的水浴热处理。/n...

【技术特征摘要】
1.一种犬纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，步骤为：
(1)将检验合格的犬血浆融化，搅拌使血浆完全溶解，调节血浆温度到-4～0℃，将其pH值调节到6.4～7.4，加入预冷乙醇至终浓度8％～10％(g/100ml)，离心保留沉淀；
(2)上述沉淀加入8～10倍量的溶解液溶解，用连续离心机离心取上清；
(3)所得的上清液中添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40～100rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6～8小时；
(4)层析：用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的犬纤维蛋白原洗涤出来一并收集；
(5)在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸/氯化钠，终浓度甘氨酸为0.9～1.5mol/L；氯化钠为1.5～2.5mol/L。待甘氨酸/氯化钠充分溶解完全后，将溶液冷却至0～10℃，用离心机对其以2000～5000rmp的速度进行连续离心分离；
(6)用溶解液溶解步骤(5)所得的沉淀，搅拌2～6小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0～3.0％，并用0.5M盐酸溶液或0.5M氢氧化钠溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪志辉，石文达，赵彦智，刘方，刘继红，王宏伟，
申请(专利权)人：泰州博莱得利生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32