【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及无氧发酵生产丁酸丁酯。
技术介绍
1、丁酸丁酯是一种具有菠萝香气的短链酯，在自然界中存在于花朵、水果和发酵饮料中。因独特的香气，丁酸丁酯作为添加剂被广泛应用于可食品工业和化妆品制造业中，除此之外，丁酸丁酯还因具有溶剂的特性被用做有机合成的原料和中间体。工业上合成丁酸丁酯常用化学催化法生产，通常是由正丁酸和正丁醇在催化剂作用下酯化而成，传统催化剂，如浓硫酸，新型催化剂，如对甲苯磺酸、氨基磺酸、十二水合硫酸铁铵和固体超强酸等，适用化学法的优点有催化时间短和酯化效率高，但缺点不可避免，污染环境、催化剂的回收利用步骤繁琐、后处理工艺复杂，都是需待解决的问题。
2、近年来生物法合成丁酸丁酯成为趋势。现主要有两种方法，第一种方法是使用脂肪酶法催化，将丁酸和丁醇酯化为丁酸丁酯。脂肪酶来自rhizopus orysae、mucor miehei、candida antarctica和c.rugosa等，催化合成丁酸丁酯的得率在69％到80％之间。脂肪酶参与的催化反应具有不需要辅酶、反应条件温和、副产物少等优点，但也存在以下问题：首先是需额外添加脂肪酶，而脂肪酶的价格较昂贵；二是脂肪酶催化的反应是可逆的，脂肪酶又称甘油酯水解酶，可催化三酰甘油水解生成游离脂肪酸和甘油，所以必须加入萃取剂及时将产物丁酸丁酯移走，以促进酯的合成反应；三是在使用该方法时需额外添加丁醇和/或丁酸。如2017年，zhong-tian zhang等人，使用一株丁酸梭菌clostridiumtyrobutyricumatcc 25755，
3、第二种方法是发酵法：利用天然筛选的菌株或遗传改造使菌株具有丁醇和丁酰辅酶a合成能力，在醇酰基转移酶作用下二者可转化为丁酸丁酯，从而实现发酵直接生产丁酸丁酯。目前已报道的发酵法生产丁酸丁酯水平普遍偏低，如2018年hyeon ji noh等人，在丙酮丁醇梭菌atcc 824中表达草莓来源的醇酰基转移酶saat基因，发酵培养72h，消耗29.16g/l葡萄糖，产生了50.07mg/l的丁酸丁酯，同时副产丁醇、乙醇、丙酮等副产物，丁酸丁酯对葡萄糖的碳摩尔得率仅有0.3％。2023年王菊芳等人在酪丁酸梭菌中表达丙酮丁醇梭菌atcc824来源的adhe2和fragaria vesca来源的醇酰基转移酶vaat基因，25℃发酵168h，消耗51.72g/l葡萄糖，在萃取剂中检测到4.58g/l的丁酸丁酯(,萃取相与发酵液的比例为1:2，折合实际产生2.29g/l丁酸丁酯)，丁酸丁酯对葡萄糖的碳摩尔得率为7.4％，发酵产物中残留高浓度的丁酸和乙酸。随后以甘露醇为底物，为合成丁酸丁酯的途径提供还原力nadh，在5l发酵罐中发酵近200h，使丁酸丁酯对甘露醇的得率达到0.21mol/mol，即碳摩尔得率为0.28。可见，目前发酵法直接生产丁酸丁酯的产量和得率都非常低。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术为了实现高效生产丁酸丁酯的目的，在丁酸丁酯合成菌株中引入乙酸代谢途径，以乙酸作为电子受体，用乙酸代谢途径消耗过剩的还原力，同时提高产品的碳原子经济性。
2、本专利技术公开了一株工程菌株eb243 ped-saat-ecacs*，包括：突变体ecacs*和saat片段。
3、在本专利技术的具体实施例中，所述的突变体ecacs*的氨基酸序列如序列表seq idno.3所示。
4、在本专利技术的具体实施例中，所述的saat片段的核酸序列如序列表seq id no.6所示。
5、进一步地，在本专利技术的具体实施例中，所述的工程菌株eb243ped-saat-ecacs*，还包括质粒ped31。
6、进一步地，在本专利技术的具体实施例中，所述的工程菌株eb243ped-saat-ecacs*，还包括大肠杆菌eb243。
7、另外，本专利技术还提供了一种所述的工程菌株eb243 ped-saat-ecacs*在利用葡萄糖和乙酸制备丁酸丁酯中的应用。
8、第三，本专利技术另外提供给了一种所述的工程菌株eb243 ped-saat-ecacs*的构建方法，包括如下步骤：将质粒ped-saat-ecacs*转入大肠杆菌eb243中，得到工程菌株eb243ped-saat-ecacs*；所述质粒ped-saat-ecacs*的构建，是将突变体ecacs*插入质粒ped-saat上获得；所述质粒ped-saat的构建，是将质粒ped-saat-his去除his标签后获得；所述质粒ped-saat-his的构建，是用引物saat-ncoi-f和引物his-xhol-r扩增saat片段后插入ped31质粒中获得。
9、在本专利技术的具体实施例中，，所述突变体ecacs*的氨基酸序列如序列表seq idno.3所示。
10、在本专利技术的具体实施例中，所述saat片段的核酸序列如序列表seq id no.6所示。
11、本专利技术的方案实现了丁酸丁酯无氧发酵生产，且发酵产丁酸丁酯得率显著高于目前已报道的得率。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.工程菌株EB243 pED-SAAT-EcACS*，其特征在于，包括：突变体EcACS*和SAAT片段。
2.依据权利要求1所述的工程菌株EB243 pED-SAAT-EcACS*，其特征在于，所述的突变体EcACS*的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
3.依据权利要求1所述的工程菌株EB243 pED-SAAT-EcACS*，其特征在于，所述的SAAT片段的核酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。
4.依据权利要求1所述的工程菌株EB243 pED-SAAT-EcACS*，其特征在于，还包括质粒pED31。
5.依据权利要求1所述的工程菌株EB243 pED-SAAT-EcACS*，其特征在于，还包括大肠杆菌EB243。
6.权利要求1至5中任一所述的工程菌株EB243 pED-SAAT-EcACS*在利用葡萄糖和乙酸制备丁酸丁酯中的应用。
7.权利要求1至5中任一所述的工程菌株EB243 pED-SAAT-EcACS*的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.依据权利要
9.依据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述SAAT片段的核酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。
...【技术特征摘要】
1.工程菌株eb243 ped-saat-ecacs*，其特征在于，包括：突变体ecacs*和saat片段。
2.依据权利要求1所述的工程菌株eb243 ped-saat-ecacs*，其特征在于，所述的突变体ecacs*的氨基酸序列如序列表seq id no.3所示。
3.依据权利要求1所述的工程菌株eb243 ped-saat-ecacs*，其特征在于，所述的saat片段的核酸序列如序列表seq id no.6所示。
4.依据权利要求1所述的工程菌株eb243 ped-saat-ecacs*，其特征在于，还包括质粒ped31。
5.依据权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：张延平，张天瑞，李寅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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