一种用于B族链球菌核酸检测的试剂盒及检测方法技术

技术编号：40104161 阅读：4 留言：0更新日期：2024-01-23 18:09

本发明专利技术属于链球菌核酸检测技术领域，提供了一种用于B族链球菌核酸检测的试剂盒及检测方法，所述试剂盒包含如下所述的引物探针组：针对B族链球菌CAMP基因位点、SrtA基因位点的检测引物探针和针对内源性内参人血红蛋白β亚基HBB基因；该检测方法：首先采用试剂盒自带提取试剂，抽提8例样品；接着将提取产物加入预先配置的PCR反应体系中混匀；然后对8例样品进行检测，可实现短时间内对生殖道分泌物及直肠分泌物样本中B族链球菌(GBS)DNA的检测，且准确率、特异性、灵敏度具有优势，本发明专利技术通过采用“荧光PCR技术”进行扩增，可在40mi n内完成扩增，缩短样本到报告的出具时间，可以更方便的供实验室、临床研究使用。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于链球菌核酸检测，具体地说是一种用于b族链球菌核酸检测的试剂盒及检测方法。

技术介绍

1、b族链球菌也称无乳链球菌，为一种β溶血的革兰阳性球菌；通常寄宿于生殖道和直肠，引起孕产妇的绒毛膜羊膜炎，导致流产、胎膜早破及宫内感染，可通过产道传播给新生儿，引起新生儿发生肺炎、脑膜炎、败血症等，死亡率极高，并且通常伴有神经系统后遗症；此外，b族链球菌还能够引起牛乳房炎，危害畜牧业。

2、b族链球菌感染也称作乙型链球菌感染，是新生儿败血症和脑膜炎、以及母亲感染的重要原因。2021年8月我国首个《预防围产期b族链球菌病(中国)专家共识》发布，首次明确推荐对所有孕35～37周的孕妇行gbs筛查。根据分娩前得到筛查结果，患者可在住院后立即得到静脉注射抗生素治疗。

3、目前主要的检测方法为荧光pcr法，专利号为200410049736.4，名称为“用于检测b族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、试剂盒及方法”的专利技术专利是一种用荧光pcr方法检测gbs，最快可以在2-3小时内完成，但其引物和探针序列设计复杂，检测时长较长，且灵敏性、特异性不佳，同时存在漏检的可能。

4、为此，本领域技术人员提出了一种用于b族链球菌核酸检测的试剂盒及检测方法来解决
技术介绍
提出的问题。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于b族链球菌核酸检测的试剂盒及检测方法，以解决现有技术中存在的问题。

2、一种用于b族链球菌核酸检测的试剂盒及检测方法

3、(1)针对camp基因位点的检测引物：如seq id no.1所示的上游引物、seq id no.2所示的下游引物和seq id no.3所示的探针，所述seq id no.3所示的探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有非荧光淬灭基团，其中，引物和探针具体的碱基序列如下所示：

4、camp基因上游引物：

5、5’-caccagctgtattagaagtacatgc-3’如seq id no.1所示；

6、camp基因下游引物：

7、5’-gccatttgctgggcttgatta-3’如seq id no.2所示；

8、camp基因探针：

9、5’fam-tgatcaagtgacaactccacaagtggta-3’bhq1如seq id no.3所示；

10、(2)针对srta基因位点的检测引物：如seq id no.4所示的上游引物、seq id no.5所示的下游引物和seq id no.6所示的探针，所述seq id no.6所示的探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有非荧光淬灭基团，其中，引物和探针具体的碱基序列如下所示：

11、srta基因上游引物：

12、5’-tcaaaggactgggcaatacaga-3’如seq id no.4所示；

13、srta基因下游引物：

14、5’-gggcctcccataatctggttt-3’如seq id no.5所示；

15、srta基因探针：

16、5’fam-tgagttatggtgcaggaacgatgaa-3’bhq1如seq id no.6所示。

17、(3)针对hbb基因位点的检测引物：如seq id no.7所示的上游引物、seq id no.8所示的下游引物和seq id no.9所示的探针，所述seq id no.9所示的探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有非荧光淬灭基团，其中，引物和探针具体的碱基序列如下所示：

18、hbb基因上游引物：

19、5’-gcccatcactttggcaaagaat-3’如seq id no.7所示；

20、hbb基因下游引物：

21、5’-caccagccaccactttctgatag-3’如seq id no.8所示；

22、hbb基因探针：

23、5’cy5-cccaccagtgcaggct-3’bhq2如seq id no.9所示；

24、优选的，所述seq id no.3所示的探针5’端连接的荧光报告基团为fam，3’端连接的非荧光淬灭基团为bhq1；

25、所述seq id no.6所示的探针5’端连接的荧光报告基团为fam，3’端连接的非荧光淬灭基团为bhq1。

26、所述seq id no.9所示的探针5’端连接的荧光报告基团为cy5，3’端连接的非荧光淬灭基团为bhq2。

27、优选的，所述引物探针组的工作浓度为：seq id no.1、seq id no.2、seq idno.4、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.8所示的引物0.2-0.5umol/l，优选的seq idno.3、seq id no.6、seq id no.9所示的探针0.1-0.3umol/l。

28、优选的，所述检测试剂盒还包含以下组分：pcr缓冲液、mg2+、dntps、ung酶和dna聚合酶；所述dntps包含datp、dgtp、dutp和dctp，且所述datp、dgtp和dctp的浓度相同、且dutp浓度加倍；所述mg2+由mgcl2提供。

29、优选的，所述pcr缓冲液包含tris-hcl和kcl；所述pcr缓冲液的ph值为7.8-9.3。

30、优选的，所述pcr缓冲液、mg2+、dntps、ung酶和dna聚合酶反应时的终浓度为：tris-hcl 4-16mmol/l、kcl 25-75nmol/l、mg2+3.0-7.5mmol/l、dntps 0.1-0.65mmol/l、ung酶0.02-0.2u/μl和dna聚合酶0.05-0.35u/μl。

31、一种用于b族链球菌核酸检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：首先采用试剂盒自带提取试剂，抽提8例样品；接着将上述提取产物20μl加入预配置的30μlpcr反应体系中；然后对8例样品进行检测，将检测结果与预期结果进行比对。

32、优选的，所述8例样品所采用的检测程序为50℃2min 1cycle；95℃3min 1cycle；95℃10s、60℃20s 40cycles。

33、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：

34、本专利技术通过采用“荧光pcr技术”进行扩增，可在40min内完成扩增，缩短样本到报告的出具时间，可以更方便的供实验室、临床研究使用，该检测的准确度、特异性以及灵敏度较高，加入两组引物探针降低了漏检的可能，同时使用内源性内参有利于实现从样本采集到测试完成的全过程实验效果监测。

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【技术保护点】

1.一种用于B族链球菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含如下所述的引物探针组：

2.如权利要求1所述一种用于B族链球菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述SEQ IDNo.3所示的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ1；

3.如权利要求1所述一种用于B族链球菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述引物探针组的工作浓度为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的引物0.2-0.5umol/L，优选的SEQ ID No.3、SEQ ID No.6、SEQ ID No.9所示的探针0.1-0.3umo l/L。

4.如权利要求1所述一种用于B族链球菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包含以下组分：PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs、UNG酶和DNA聚合酶；所述dNTPs包含dATP、dGTP、dUTP和dCTP，且所述dATP、dGTP和dCTP的浓度相同、且dUTP浓度加倍；所述Mg2+由MgCl2提供。

5.如权利要求4所述一种用于B族链球菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包含Tris-HCl和KCl；所述PCR缓冲液的pH值为7.8-9.3。

6.如权利要求4所述一种用于B族链球菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs、UNG酶和DNA聚合酶反应时的终浓度为：Tris-HCl 4-16mmol/L、KCl 25-75nmol/L、Mg2+3.0-7.5mmol/L、dNTPs 0.1-0.65mmol/L、UNG酶0.02-0.2U/μl和DNA聚合酶0.05-0.35U/μl。

7.如权利要求1-6任意一项所述的一种用于B族链球菌核酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：首先采用试剂盒自带提取试剂，抽提上述8例样品；接着将上述8例样品的提取产物取20μl加入预配置的30μlPCR反应体系中混匀；然后对上述8例样品进行检测，将检测结果与预期结果进行比对。

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【技术特征摘要】

1.一种用于b族链球菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含如下所述的引物探针组：

2.如权利要求1所述一种用于b族链球菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述seq idno.3所示的探针5’端连接的荧光报告基团为fam，3’端连接的非荧光淬灭基团为bhq1；

3.如权利要求1所述一种用于b族链球菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述引物探针组的工作浓度为：seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.8所示的引物0.2-0.5umol/l，优选的seq id no.3、seq id no.6、seq id no.9所示的探针0.1-0.3umo l/l。

4.如权利要求1所述一种用于b族链球菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包含以下组分：pcr缓冲液、mg2+、dntps、ung酶和dna聚合酶；所述dntps包含datp、dgtp、dutp和dctp，且所述datp、dgt...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丹，冀俊峰，
申请(专利权)人：孚清诊断产品嘉善有限公司，
类型：发明
国别省市：

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