【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生产l-谷氨酸的棒状杆菌属变异微生物及利用其的l-谷氨酸的生产方法，更具体而言，涉及参与l-谷氨酸生物合成途径的nadp依赖性苹果酸酶新型变体、多核苷酸和转化体、以及利用其的l-谷氨酸的生产方法。
技术介绍
1、l-谷氨酸是通过微生物发酵而生产的代表性的氨基酸，l-谷氨酸钠(monosodiuml-glutamate，msg)对食物的整体味道进行平衡和调和，以提高肉、鱼、鸡、蔬菜、酱汁、汤汁、酱料等食品的喜好度，并且可以增进将食盐减少到30％的低盐食品的味道，因此被广泛用作家用和加工食品生产用的调味料。
2、简单地研究l-谷氨酸的发酵途径，葡萄糖主要经过糖酵解途径(glycolyticpathway)，但一部分经过戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway)代谢为两个分子的丙酮酸(pyruvic acid)。其中一个分子固定co2而成为草酰乙酸(oxaloacetic acid)，另一个分子与乙酰辅酶a(acetyl coa)结合，由丙酮酸成为枸橼酸(citric acid)。草酰乙酸和枸橼酸再次进入三羧酸循环(tcacycle)成为α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid)。其中，由于缺少从α-酮戊二酸氧化为琥珀酸(succinic acid)的氧化代谢途径，加之异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase)和谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)的密切参与，因此α-酮戊二酸的还原性氨基酸化反应高效进行，从而生成l-谷氨酸。
3、l-谷氨酸的生产可以利用自然状态下获得的野生型菌株或者以提高其谷氨酸生产能力的方式改变的变异株。近年来，为了改善l-谷氨酸的生产效率，以多用于氨基酸、核酸之类的有用物质的生产的大肠杆菌、棒状杆菌等微生物为对象，适用基因重组技术，从而开发了具有优异的l-谷氨酸生产能力的各种重组菌株或变异株及利用其的l-谷氨酸生产方法。特别是，进行了如下尝试：以参与l-谷氨酸的生物合成途径的酶、转录因子、运输蛋白质等的基因为靶向、或者对调控它们的表达的启动子诱导变异，从而扩大l-谷氨酸的生产量。但是，与l-谷氨酸生产直接或间接相关的酶、转录因子、运输蛋白质等蛋白质的种类达到数十余种，因此关于根据这样的蛋白质的活性变化的l-谷氨酸生产能力是否增加，事实上仍需要大量的研究。
4、现有技术文献
5、专利文献
6、美国授权专利第6852516号
7、美国授权专利第6962805号
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供新型的nadp依赖性苹果酸酶变体。
2、另外，本专利技术提供编码上述变体的多核苷酸。
3、另外，本专利技术提供包含上述变体或多核苷酸的转化体。
4、另外，本专利技术的目的在于提供利用了上述转化体的l-谷氨酸的生产方法。
5、本专利技术的一个方式提供由seq id no:2的氨基酸序列组成的nadp依赖性苹果酸酶变体，是seq id no:4的氨基酸序列中的第372号天冬氨酸被置换为天冬酰胺而成的。
6、本专利技术中所使用的“nadp依赖性苹果酸酶(nadp-dependent malic enzyme)”是一种催化苹果酸的氧化脱羧化而生成丙酮酸和co2以及na dph的酶，起到为三羧酸循环供应所需的碳源的作用。上述nadp依赖性苹果酸酶可以是编码nadp依赖性苹果酸酶的基因或与其具有实质同一性的序列。在这里，“实质同一性”是指在将各个基因序列，即碱基序列或核苷酸序列和任意的其它核苷酸序列以最大程度对应的方式对齐而进行分析时，上述任意的其它核苷酸序列和各个核苷酸序列具有70％以上、80％以上、90％以上或98％以上的序列同源性。
7、本专利技术中的nadp依赖性苹果酸酶包含seq id no:4的氨基酸序列。
8、根据本专利技术的一具体例，上述seq id no:4的氨基酸序列可以源于野生型棒状杆菌(corynebacterium)属微生物。
9、更具体而言，上述棒状杆菌属微生物可以为谷氨酸棒状杆菌(coryn ebacteriumglutamicum)。
10、本专利技术中所使用的“变体”是指如下的多肽，该多肽的特定基因的氨基酸序列的n-末端、c-末端和/或内部中的一个以上的氨基酸被保守性置换(conservativesubstitution)、剔除(deletion)、改变(modification)或增加，从而与上述变体的变异前的氨基酸序列不同，但维持了功能(functions)或特性(properties)。在这里，“保守性置换”是指将一个氨基酸置换为结构和/或化学性质相似的其它氨基酸，对蛋白质或多肽的活性几乎不产生影响，或者可以完全不产生影响。上述氨基酸选自丙氨酸(ala)、异亮氨酸(ile)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、甲硫氨酸(met)、天冬酰胺(asn)、半胱氨酸(cys)、谷氨酰胺(gln)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)、赖氨酸(lys)、甘氨酸(gly)和脯氨酸(pro)。
11、另外，变体包括一个以上的n-末端前导序列或跨膜结构域(transmembranedomain)之类的部分被剔除的变体、或者一部分从成熟蛋白质(mature protein)的n-和/或c-末端被剔除的变体。与变异前的多肽相比，这样的变体其能力可以增加或不变或减少。在本专利技术中，变体可以与变异型、改变、变异型多肽、变异的蛋白质、变异等混用。
12、本专利技术中的变体是一种nadp依赖性苹果酸酶，是位于seq id no:4的氨基酸序列中的第372号的氨基酸即天冬氨酸被置换为天冬酰胺而成的，可以由seq id no:2的氨基酸序列组成。
13、本专利技术的另一方式提供编码上述nadp依赖性苹果酸酶变体的多核苷酸。
14、本专利技术中所使用的“多核苷酸(polynucleotide)”是核苷酸单体(monomer)通过共价键以链状长长地连接而成的核苷酸的聚合物(polymer)，是一定长度以上的dna或rna链，更具体而言，是指编码上述变体的多核苷酸片段。
15、上述多核苷酸可以包含编码seq id no:2的氨基酸序列的碱基序列。
16、根据本专利技术的一具体例，上述多核苷酸可以包含由seq id no:1表示的碱基序列。
17、本专利技术的另一方式提供包含编码上述nadp依赖性苹果酸酶变体的多核苷酸的载体。
18、另外，本专利技术的另一方式提供包含上述nadp依赖性苹果酸酶变体或多核苷酸的转化体。
19、本专利技术中所使用的“载体(vector)”是指作为用于向宿主细胞传递、表达目标基因的手段所使用的所有类型的核酸序列转运结构体。除非另有说明，否则上述载本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的NADP依赖性苹果酸酶变体，是SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的第372号天冬氨酸被置换为天冬酰胺而成的。
2.一种多核苷酸，编码权利要求1的变体。
3.一种转化体，包含权利要求1的变体或权利要求2的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的转化体，其中，所述转化体为棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物。
5.根据权利要求3所述的转化体，其中，所述转化体具有L-谷氨酸生产能力。
6.一种L-谷氨酸的生产方法，包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种由seq id no:2的氨基酸序列组成的nadp依赖性苹果酸酶变体，是seq id no:4的氨基酸序列中的第372号天冬氨酸被置换为天冬酰胺而成的。
2.一种多核苷酸，编码权利要求1的变体。
3.一种转化体，包含权利要求1的变体或权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：李善熙，金玄浩，金东铉，金贤淑，朴硕贤，朴俊炫，
申请(专利权)人：大象株式会社，
类型：发明
国别省市：
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