本发明专利技术公开了表达SARS‑CoV‑2Omicron Spike蛋白的重组腺病毒及其应用。本发明专利技术提供的重组腺病毒是将重组质粒转染腺病毒包装细胞然后进行细胞培养得到的。所述重组质粒为将编码序列3所示蛋白质的DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体得到的。本发明专利技术在黑猩猩腺病毒载体的△E1区域插入全长SARS‑CoV‑2Omicron变异株Spike蛋白变体的编码基因，通过腺病毒侵染细胞将遗传物质导入靶细胞中转录表达相应的抗原蛋白。蛋白变体中具有膜锚定信号肽、跨膜区和胞内区，所以表达好的蛋白不会分泌到胞外，而是模拟病毒颗粒表面刺突，插在靶细胞的膜上从而起到免疫原的作用，刺激机体产生免疫反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及表达sars-cov-2 omicron spike蛋白的重组腺病毒及其应用。
技术介绍
1、新型冠状病毒(sars-cov-2)出现在全球多个国家和地区。多数sars-cov-2感染病人均会出现严重的呼吸道疾病。由于这种疾病可以人传染给人，因此引起了全世界的高度关注，成为影响人类健康的重大威胁之一。
2、随着传播进程，sars-cov-2产生了许多突变，导致新变异株的传播能力不断增强，并产生了不同程度的免疫逃逸，主要流行变异株例如alpha株、beta株、gamma株、delta株和omicron株等。变异株的出现导致疫苗的保护效力产生不同程度的下降，许多单克隆抗体也对突变株的中和活性减弱甚至完全失去中和活性。发现预防新型变异株病毒的疫苗成为阻止疫情持续爆发的重要途径。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供表达sars-cov-2 omicron spike蛋白的重组腺病毒及其应用。
2、本专利技术提供的重组腺病毒，为表达序列表的序列3所示蛋白质的重组腺病毒。
3、本专利技术还保护蛋白质，为序列表的序列3所示的蛋白质。
4、序列表的序列3所示的蛋白质即全长sars-cov-2 omicron变异株spike蛋白变体。
5、本专利技术还保护编码所述蛋白质的核酸分子。
6、所述核酸分子具体可为dna分子。
7、所述dna分子具体可为序列表的序列4所示的dna分子。
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p>8、本专利技术还保护重组质粒，为将编码序列表的序列3所示蛋白质的dna分子插入黑猩猩腺病毒载体得到的重组质粒。9、编码序列表的序列3所示蛋白质的dna分子具体可为序列表的序列4所示的dna分子。
10、所述黑猩猩腺病毒载体可为源于simian adenovirus 25(ncbi referencesequence:ac_000011.1)的腺病毒载体。
11、所述黑猩猩腺病毒载体中，对simian adenovirus 25进行了如下改造：e1和e3部分区域均已删除，e1部分区域删除使得产生的重组病毒不能在普通细胞复制以增强其生物安全性，e3区域部分删除增加了外源基因的插入容量。
12、所述黑猩猩腺病毒载体具体可为padc68xy4 padc68-δe1(gfp)-δe3(swai)-e4(orf3-6hu5)载体。
13、padc68xy4 padc68-δe1(gfp)-δe3(swai)-e4(orf3-6hu5)载体为环形质粒，如序列表的序列5所示。
14、所述重组质粒中，dna分子插入黑猩猩腺病毒载体的△e1区域。
15、所述重组质粒中，用所述dna分子取代padc68xy4 padc68-δe1(gfp)-δe3(swai)-e4(orf3-6hu5)载体的两个srfi酶切位点之间的小片段。
16、本专利技术还保护重组腺病毒，是将以上任一所述重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养得到的。
17、所述细胞培养可为单次细胞培养。
18、所述细胞培养可为多次连续细胞培养。
19、所述细胞培养为多次连续细胞培养时，第一次细胞培养为将重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行培养。所述细胞培养为多次连续细胞培养时，从第二次细胞培养开始，每次细胞培养的步骤均为：将上一代细胞培养完成后收集细胞并破碎后收集的上清液感染新的腺病毒包装细胞，然后进行培养。所述细胞培养为多次连续细胞培养时，最后一次细胞培养后，收集细胞并破碎，然后收集的上清液，进行病毒纯化，得到病毒液。
20、所述重组腺病毒的制备方法，依次包括如下步骤：
21、(1)将线性化的重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后培养至80％左右的细胞可以观察到噬斑形成；
22、(2)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液。
23、所述重组腺病毒的制备方法，依次包括如下步骤：
24、(1)将线性化的重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后培养至80％左右的细胞可以观察到噬斑形成；
25、(2)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；
26、(3)将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态；
27、(4)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；
28、(5)将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态；
29、(6)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；
30、(7)将上清液感染腺病毒包装细胞，培养至绝大多数细胞为漂浮状态；
31、(8)收集细胞，采用反复冻融的方式进行细胞破碎，然后离心收集上清液；
32、(9)取上清液，进行氯化铯密度梯度离心纯化，获得病毒液。
33、线性化的重组质粒具体为：采用限制性内切酶paci酶切重组质粒得到的大片段(约31kb)。
34、本专利技术还保护一种用于制备重组腺病毒的试剂盒，包括以上任一所述重组质粒和腺病毒包装细胞。
35、所述腺病毒包装细胞中具有腺病毒e1基因。所述腺病毒包装细胞具体为hek293a细胞。
36、本专利技术还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述重组腺病毒。
37、本专利技术还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述蛋白质或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组质粒。
38、所述产品的用途为如下(e1)或(e2)或(e3)：
39、(e1)作为新型冠状病毒抑制剂；
40、(e2)作为新型冠状病毒疫苗；
41、(e3)作为抗新型冠状病毒药物。
42、本专利技术还保护以上任一所述重组腺病毒的应用。
43、本专利技术还保护以上任一所述蛋白质或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组质粒的应用。
44、本专利技术还保护所述试剂盒的应用。
45、以上任一所述应用为如下(f1)或(f2)或(f3)：
46、(f1)制备新型冠状病毒抑制剂；
47、(f2)制备新型冠状病毒疫苗；
48、(f3)制备抗新型冠状病毒药物。
49、所述重组腺病毒可以引起生物体产生抗体，抗体对新型冠状病毒具有中和作用。
50、以上任一所述新型冠状病毒具体可为新型冠状病毒奥密克戎毒株(sars-cov-2omicron)。
51、本专利技术中包含1种sars-cov-2抗原蛋白形式：全长s蛋白尽可能地保证原始的s结构，不仅保留膜锚定信号肽，还保留了s2后部的跨膜区和胞内区，s2亚单位包含2个氨基酸突变(序列1中的第983-984位氨基酸残基“kv”替换为了“pp”)使得s蛋白保持更加稳定的三聚体构象，尽可能地模拟刺突蛋白锚定在本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.表达序列表的序列3所示蛋白质的重组腺病毒。
2.序列表的序列3所示的蛋白质。
3.编码权利要求2所述蛋白质的核酸分子。
4.将编码序列表的序列3所示蛋白质的DNA分子插入黑猩猩腺病毒载体得到的重组质粒。
5.重组腺病毒，是将权利要求4所述重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养得到的。
6.一种用于制备重组腺病毒的试剂盒，包括权利要求4所述重组质粒和腺病毒包装细胞。
7.一种产品，其活性成分为权利要求1或5所述重组腺病毒或者为权利要求2所述蛋白质或者为权利要求3所述核酸分子或者为权利要求4所述重组质粒；
8.权利要求1或5所述重组腺病毒的应用，为如下(f1)或(f2)或(f3)：
9.权利要求2所述蛋白质或者权利要求3所述核酸分子或者权利要求4所述重组质粒的应用，为如下(f1)或(f2)或(f3)：
10.权利要求6所述试剂盒的应用，为如下(f1)或(f2)或(f3)：
【技术特征摘要】
1.表达序列表的序列3所示蛋白质的重组腺病毒。
2.序列表的序列3所示的蛋白质。
3.编码权利要求2所述蛋白质的核酸分子。
4.将编码序列表的序列3所示蛋白质的dna分子插入黑猩猩腺病毒载体得到的重组质粒。
5.重组腺病毒，是将权利要求4所述重组质粒转染腺病毒包装细胞，然后进行细胞培养得到的。
6.一种用于制备重组腺病毒的试剂盒，包括权利要求4所述重组质粒和腺病毒包装细胞。
【专利技术属性】
技术研发人员：张林琦，李明茜，王若珂，史宣玲，张绮，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：
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