【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物病毒学及生物制剂，具体涉及海藻酸钙-壳聚糖凝胶在针对pedv口服疫苗递送中的保护性应用。
技术介绍
1、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)所引起的一种急性、高度接触性肠道性传染病，主要侵害仔猪，病死率高，危害巨大。pedv感染肠道上皮细胞，促使肠系膜淋巴结产生能够合成iga的淋巴浆母细胞，一部分淋巴浆母细胞转移到乳腺分泌iga，即肠道-乳腺-siga轴。母猪肠道黏膜及乳汁中的高水平iga抗体是保护母猪及仔猪的一种有效措施。目前可用的pedv疫苗是通过肌肉注射或皮下注射接种的，诱导全身免疫球蛋白 igg反应。然而，血清igg并不能有效预防肠道黏膜pedv感染。因此，研制新型疫苗诱导肠黏膜免疫应答，促进肠黏膜iga的产生，对防治pedv具有重要意义。
2、口服免疫被认为是诱导肠黏膜免疫的有效策略。然而，胃酸和蛋白酶介导的胃肠道降解，使大量抗原丢失，导致对肠道病原体感染的保护能力减弱。壳聚糖是一种阳离子线性多糖，由β(1→4)连接的d-氨基葡萄糖残基和随机分布的n -乙酰氨基葡萄糖基组成。海藻酸盐是一种天然的阴离子线性多糖，由1-4连接的α- l -古洛醛酸和β- d -甘露糖醛酸残基交替组成。壳聚糖与海藻酸盐具有很高的ph敏感性，利用阴阳离子间的静电相互作用,研究者将壳聚糖与海藻酸盐结合，形成 ph 敏感 pecs，应用于口服药物载体中。另外，壳聚糖与海藻酸盐具有生物相
3、口服免疫诱导肠黏膜免疫是有效预防肠道黏膜pedv感染的关键。壳聚糖与海藻酸盐聚合形成的凝胶聚合物可有效避免胃肠道中低ph及蛋白酶的降解。因此，本研究旨在初步探索alg-cs凝胶在针对pedv的肠道黏膜免疫中的作用。
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术提供了alg-cs凝胶在制备针对pedv的口服疫苗递送中的保护性应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下实验技术方案。一种基于alg-cs凝胶的pedv口服疫苗的制备方法，具体步骤如下
3、1. 制备alg-cs+pedv凝胶
4、2%海藻酸钙溶液的制备，称取0.2g海藻酸钙粉末溶于10ml温度达90度的蒸馏水中，充分混匀，此溶液为溶液1。
5、1%壳聚糖溶液的制备，称取0.1g壳聚糖粉末溶于500µl 冰醋酸后，补充蒸馏水至10ml，充分混匀，此溶液为溶液2。
6、将含106.5tcid50/ml的pedv冻干粉溶于溶液1中，充分混匀。将溶液1与溶液2充分混匀。
7、2. 小鼠免疫
8、15只6周龄balb/c雌鼠分为5组，每组3只小鼠。第一组小鼠口服alg-cs凝胶作为阴性对照组。第二组小鼠口服alg-cs+pedv凝胶。第三组小鼠口服pedv活疫苗。第四组小鼠皮下注射pedv活疫苗。最后一组小鼠皮下注射dmem。每组小鼠给予的剂量均为0.2ml。小鼠免疫方案如图所示，皮下注射组及口服免疫组小鼠分别免疫2次及3次后加强免疫。
9、3. elisa检测血清、脾及肠匀浆液中抗体水平
10、在小鼠免疫中的7d、14d、28d取血清检测igg及iga抗体水平。1-32d采小鼠粪便检测iga抗体水平。35d取小鼠脾、肠检测体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫水平。小鼠下颌静脉采血后 37 ℃放置 1 h，2800rpm 离心 10 min，取上清。小鼠0.1g粪便用500μl粪便溶解液（pbs+ 1mmol/l pmsf）溶解，4℃放置 12 h，12000rpm 离心 10 min，取上清。小鼠颈椎脱臼法处死，取小鼠脾及各肠段组织加入1ml pbs匀浆，12000rpm离心 10 min，取上清。收集的血清、脾及各肠段组织的匀浆液通过以下 elisa 步骤检测分析pedv特异性抗体滴度。
11、1)elisa板用包被缓冲液将病毒4℃过夜包被。pedv病毒液为106.5tcid50/ml。
12、2)弃去液体， pbst（pbs + 0.05% tween 20）洗涤 3 次，加入含有 5% bsa 的pbst 37 ℃封闭 1 h。
13、3)pbst 洗涤 3次，用pbs稀释的血清（1:100）、脾及肠组织匀浆液（1:10）和粪便溶解液（1:10）加入到 elisa 板的每个孔中， 37 °c 下孵育 1 h。
14、4)pbst 洗涤 3次，将 pbs 稀释的 hrp 标记的羊抗鼠 igg（1:3000），iga（1:20000）加入到孔中，100 μl/孔，37 ℃孵育 1 h。
15、5)pbst 洗涤 3次， tmb显色液100 μl/孔加入elisa 板孔中。避光孵育至颜色不再变深。
16、6)将 2 m h2so4 以50 μl/孔终止反应。
17、7)通过酶标仪测定 od450 处的吸光度。
18、4. elisa检测脾及肠匀浆液中ifn-gamma 浓度
19、疫苗免疫后 35d取小鼠脾和肠组织加入1ml pbs匀浆，然后以 12000rpm离心 10min，取上清，0.22µm滤膜过滤上清。收集的脾及各肠段的匀浆液参考mouse ifn-gammaelisa kit ( ifng) (rk00019)说明书检测ifn-gamma浓度。
20、5. alg-cs+pedv凝胶及dmem+pedv经胃肠液后感染vero的cpe
21、将alg-cs+pedv凝胶及dmem+pedv在模拟的胃肠液中在37℃烘箱孵育4h后，提取alg-cs+pedv凝胶中未溶解的pedv样溶于dmem后，感染vero后，观察cpe。将含有dmem+pedv的胃肠液0.45µm的滤膜过滤后，感染vero后，观察cpe。3d后，分别观察统计alg-cs+pedv凝胶及dmem+pedv感染vero后的cpe情况。
22、本专利技术公开提供并初步评估了一种基于alg-cs凝胶的pedv口服疫苗的作用效力。本专利技术初步评估alg-cs+pedv凝胶对小鼠体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫的作用效应，为研究针对pedv的口服疫苗的制备及口服型疫苗佐剂的研发提供基础研究数据。
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1.一种基于Alg-CS凝胶的PEDV口服疫苗的制备方法,其特征在于，以106.5TCID50/ml的PEDV冻干粉为溶质作为靶向肠道口服疫苗的免疫原，以Alg-CS凝胶为溶剂作为口服疫苗的保护载体。
2.根据权利要求1所述，其特征在于，海藻酸钙的质量浓度为2%。
3.根据权利要求1所述，其特征在于，壳聚糖的质量浓度为1%。
4.根据权利要求1-3所述，其特征在于，具体步骤如下：
5.（2）1%壳聚糖溶液的制备，称取0.1g壳聚糖粉末溶于500µl 冰醋酸后，补充蒸馏水至10ml，充分混匀，此溶液为溶液2。
6.（3）将含106.5TCID50/ml的PEDV冻干粉溶于溶液1中，充分混匀。将溶液1与溶液2充分混匀。
【技术特征摘要】
1.一种基于alg-cs凝胶的pedv口服疫苗的制备方法,其特征在于，以106.5tcid50/ml的pedv冻干粉为溶质作为靶向肠道口服疫苗的免疫原，以alg-cs凝胶为溶剂作为口服疫苗的保护载体。
2.根据权利要求1所述，其特征在于，海藻酸钙的质量浓度为2%。
3.根据权利要求1所述，其特征在于，壳聚糖的质量浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋云峰，张金花，崔蕾，周赛赛，潘红，袁红根，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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