【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤生物制品领域，涉及过继免疫治疗中的分泌pd1和ctla4双单域抗体的egfrvⅲcar-t细胞(egfrvⅲ/pd1/ctla4 nb car-t细胞)及其制备方法和应用。
技术介绍
1、t细胞可以通过表达car靶向肿瘤细胞。嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor,car)通过将可以特异性识别肿瘤抗原的单链抗体与可活化t细胞的受体胞内结构域“免疫受体酪氨酸活化基序”用人工方法融合成重组基因来制备。car-t细胞疗法是目前肿瘤免疫治疗的当下最热门最有研究价值的治疗方法。目前car-t治疗在血液肿瘤中取得了很好的进展，但是由于实体肿瘤微环境复杂，car-t对实体瘤的杀伤效果有限，因此需要探索新的方法来提高car-t治疗实体肿瘤的活性。
2、car的基础设计中包括肿瘤相关抗原结合区、胞内信号区、跨膜区、胞外铰链区等。car-t目前已经发展到第四代，在血液肿瘤中取得了很好的进展，而对于实体瘤治疗，car-t细胞疗法的效果一直不佳，其中重要原因是肿瘤特异性t细胞难以突破肿瘤微环境的免疫抑制作用。除此之外目前大多数car识别抗原的部分是由单链抗体组成的,由于不同的单链抗体的vl和vh之间会出现错配，使得表达出来单链抗体亲和力下降，也是造成car-t治疗效果不佳的原因。因此需要探索新的方法来提高car-t治疗实体肿瘤的活性。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种工程化基于单域抗体靶向egfrvⅲ且分泌pd1单域抗体和ctla4单域抗体
2、于是，本专利技术在第一方面提供了一种分泌pd1和ctla4双单域抗体的egfrvⅲcar-t细胞，所述car-t细胞表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括胞外抗原识别区egfrvⅲ单域抗体序列、铰链区cd8和跨膜区cd8串联序列、胞内共刺激域cd137序列、胞内信号转导域cd3ζ序列、pd1单域抗体序列和ctla4单域抗体序列，并且能够将pd1单域抗体和ctla4单域抗体到细胞外。
3、本专利技术在第二方面提供了一种制备本专利技术第一方面所述的car-t细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
4、(1)获取编码嵌合抗原受体的核苷酸序列；
5、(2)将所述核苷酸序列克隆到慢病毒载体中并在大肠杆菌中表达，获得包括所述核苷酸序列的重组慢病毒载体；
6、(3)使用所述重组慢病毒载体通过转染293t细胞来对慢病毒进行包装，获得包装慢病毒；
7、(4)将所述包装慢病毒与t细胞共培养，获得表达所述嵌合抗原受体并能将pd1单域抗体分泌到细胞外的car-t细胞。
8、本专利技术在第三方面提供了一种根据本专利技术第一方面所述的car-t细胞在制备治疗肿瘤制剂中的应用。
9、优选的是，所述肿瘤为egfrvⅲ阳性肿瘤。
10、本专利技术在第四方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本专利技术第一方面所述的car-t细胞或根据本专利技术第二方面所述方法制备的car-t细胞和药学上可接受的载体。
11、本专利技术在第五方面提供了一种编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列编码根据本专利技术第一方面所述的car-t细胞或根据本专利技术第二方面所述方法制备的car-t细胞表达的所述嵌合抗原受体。
12、本专利技术在第六方面提供了一种嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体为根据本专利技术第一方面所述的car-t细胞或根据本专利技术第二方面所述方法制备的car-t细胞所表达的所述嵌合抗原受体。
13、本专利技术人经过研究发现，在对egfrvⅲ阳性肿瘤免疫治疗中，靶向egfrvⅲ且分泌pd1单域抗体和ctla4单域抗体的car-t细胞能够带来相对于现有技术而言具有显著优势的技术效果：增强特异性的靶向，即增强免疫细胞靶向识别肿瘤抗原，减少对正常组织的毒副作用；所述car-t细胞(有时称为egfrvⅲ/pd1/ctla4 nb car-t细胞)所拥有的这些特性主要源于本专利技术所设计的嵌合抗原受体的功能结构，该结构包括抗原识别区域和细胞内激活区域，而细胞内激活区域能延长细胞在体内的存活时间；另外，本专利技术采用慢病毒感染进行制备car-t细胞，提供一种高效制备egfrvⅲ/pd1/ctla4 nb car-t细胞的方法，该方法制备的car-t细胞能稳定表达嵌合抗原受体，具有较好的应用前景。
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1.一种分泌PD1和CTLA4双单域抗体的EGFRvⅢCAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括胞外抗原识别区EGFRvⅢ单域抗体序列、铰链区CD8和跨膜区CD8串联序列、胞内共刺激域CD137序列、胞内信号转导域CD3ζ序列、PD1单域抗体序列和CTLA4单域抗体序列，并且能够将PD1单域抗体和CTLA4单域抗体到细胞外。
2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的CAR-T细胞，其特征在于：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的CAR-T细胞，其特征在于：
5.一种制备权利要求1至4中任一项所述的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
7.一种根据权利要求1至4中任一项所述的CAR-T细胞或根据权利要求5或6所述方法制备的CAR-T细胞在制备治疗肿瘤制剂中的应用；优选的是，所述肿瘤为EGFRvⅢ阳性肿瘤。
8.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利
9.一种编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，其特征在于：
10.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为根据权利要求1至4中任一项所述的CAR-T细胞或根据权利要求5或6所述方法制备的CAR-T细胞所表达的所述嵌合抗原受体。
...【技术特征摘要】
1.一种分泌pd1和ctla4双单域抗体的egfrvⅲcar-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括胞外抗原识别区egfrvⅲ单域抗体序列、铰链区cd8和跨膜区cd8串联序列、胞内共刺激域cd137序列、胞内信号转导域cd3ζ序列、pd1单域抗体序列和ctla4单域抗体序列，并且能够将pd1单域抗体和ctla4单域抗体到细胞外。
2.根据权利要求1所述的car-t细胞，其特征在于：
3.根据权利要求1或2所述的car-t细胞，其特征在于：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的car-t细胞，其特征在于：
5.一种制备权利要求1至4中任一项所述的car-t细胞的方法，其特征在于，所述方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢小玲，杨晓梅，李海霞，尹时华，姜晓兵，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：
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