本发明专利技术提供一种提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法。取绵羊卵巢，获卵丘卵母细胞复合体，经体外成熟培养22‑24h得绵羊成熟卵母细胞，分为对照组、新鲜处理组、冷冻组和冷冻处理组，对照组和新鲜处理组依次经孤雌激活和体外胚胎培养，而冷冻组和冷冻处理组须在孤雌激活前经冷冻解冻及恢复培养处理，新鲜(或冷冻)处理组添加左旋肉碱和甜菜碱，通过此法获得体外胚胎。本发明专利技术利用代谢组学挖掘出绵羊卵母细胞到胚胎发育过程中的关键代谢物左旋肉碱和甜菜碱，确认其具有调节氧化应激与渗透压应激功能，添加入体外成熟培养液，解冻液，恢复液，孤雌发育液和体外胚胎培养液中，显著提高冷冻解冻绵羊成熟卵母细胞的体外囊胚发育率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生殖工程，尤其涉及一种提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法。
技术介绍
1、成年绵羊的卵巢虽有几万个原始卵泡，但在整个自然繁育过程中，只有极少量的卵母细胞能受精形成胚胎，这表明大量的卵母细胞未被充分挖掘利用，难以发挥优良母羊的种质特性。如果这些卵母细胞可用于高效的超低温冷冻保存及体外胚胎生产，将极大促进羊种质资源保存和开发利用。然而，羊卵母细胞冷冻后体外发育潜力依然偏低，受精囊胚率为0-12.5％(参见参考文献[1])。因此，提升绵羊冻融卵母细胞发育潜力对于充分发挥优良母羊遗传特性，推动羊产业高效发展具有重要意义。
2、通常，超低温冷冻后细胞线粒体损伤，进而产生大量活性氧簇(ros)，导致细胞发育阻滞或凋亡。抗氧化剂在一定程度上，通过减少超低温冷冻诱发的ros，可促进冻融卵母细胞发育潜力(参见参考文献[2-5])。另一方面，超低温冷冻解冻过程的快速脱水与复水，往往会破坏细胞膜上水通道蛋白，解冻后细胞易受渗透压损伤(参见参考文献[6,7])。因此，调节解冻后胚胎的渗透压应激也可能是提升冻融卵母细胞发育潜力非常重要的方式。
3、哺乳动物卵母细胞和早期胚胎体内发育所需激素、细胞因子、能量代谢物、微量元素、维生素和氨基酸等几乎都存在于卵泡和输卵管中。然而，家畜体外培养体系与体内卵泡液及输卵管液成分还有较大差异，严重制约卵母细胞及其体外胚胎发育。因此，分析卵泡液，输卵管液成分，结合卵母细胞和胚胎代谢需求，理论上可挖掘体内高质量卵母细胞和胚胎发育所需关键物质。
4、现有技术一的技术方案</p>5、目前，asgari,v等人(参见参考文献[8])提高绵羊冻融卵母细胞体外胚胎囊胚率的方法可见报道，涉及绵羊卵母细胞体外成熟、孤雌激活体系、体外胚胎培养及玻璃化冷冻，具体如下：
6、1)体外成熟液(ivm)：
7、tcm199+10％绵羊血清+10μg/ml绵羊fsh(卵泡刺激素)+10μg/ml绵羊lh(促黄体生成素)+1μg/mle2(雌二醇)+2.5mmol/l丙酮酸钠+100μmol/legf+100μmol/ligf+1mmol/ll-glutamine+0.1mmol/lcysteamine+100iu/ml青霉素+100μg/ml链霉素。
8、2)体外培养液(ivc)：
9、改良的输卵管合成液，未见详细描述。通过改良冻融羊卵母细胞孤雌激活方法，显著提升其孤雌囊胚形成率(8.5％vs 28.4％)。
10、3)冷冻解冻方案：
11、将5个完全去除颗粒细胞的卵母细胞转至100μl含有20％羊血清的磷酸缓冲液(基础液，basal medium，bs)中孵育1min。同时，将3个100μl的平衡液液滴(equilibriumsolution,es:bs中添加7.5％eg+7.5％dmso)放置bs液滴附近。在体视显微镜下，bs液滴与附近的es液滴轻轻连接，形成bs-es液滴，再与下一个es液滴连接。最后，形成bs-es-es-es液滴。每个间隔时间为1min。然后将平衡后的卵母细胞转入含bs+15％eg+15％dmso+0.5mol/l蔗糖的玻璃化冷冻液中停留20-25sec，然后转入cryotop尖端(5个/cryotop)，并迅速投入液氮(ln2)中。卵母细胞操作室温度设置为室温(20-25℃)。卵母细胞解冻时，将cryotop从液氮中取出，尖端快速浸入解冻液1(warming solution 1，ws1:bs中含1mol/l蔗糖，温度为38.5℃)中。1min后，卵母细胞依次转入ws2(bs中含0.5mol/l蔗糖)和ws3(bs中含0.25mol/l蔗糖)中，各3min。后转入bs中孵育5min，最后转入含10％羊血清的tcm-199中。
12、4)孤雌激活：
13、将卵母细胞转入含5μmol/l钙离子霉素的htcm-199中孵育5min。激活后彻底清洗，然后转入含2mmol/l的6-dmap(n6,n6-二甲基氨基嘌呤)孵育2h。最后将孵育的卵母细胞10个一组，于20μl改良合成输卵管液中培养。
14、现有技术一的缺点
15、1)现有技术中，通过对比新鲜卵母细胞与冷冻卵母细胞对孤雌激活方案药物的敏感性不同，在新鲜卵母细胞孤雌激活的基础上，改变孤雌激活药物钙离子霉素(ionomycin)的作用浓度与作用时间，提升冻融绵羊卵母细胞的囊胚发育率(8.5％vs 28.4％)。但是，现有技术仅仅是改变孤雌激活方法中药物作用时间与作用浓度，以此提升冻融卵母细胞孤雌激活后的发育潜力。
16、2)现有技术中，绵羊卵母细胞孤雌激活后的体外囊胚率最高为41.8％，仍较低，说明现有技术的体外发育体系还有待提升。
17、现有技术二的技术方案
18、现有技术中，有显著提升绵羊卵母细胞体外囊胚发育率的文献：杨楠等人(参见参考文献[9])。
19、其成熟体系、孤雌激活体系、体外胚胎培养体系如下：
20、1)体外成熟液(ivm)：tcm199+20％胎牛血清(fbs)+0.05iu/ml fsh+0.05iu/ml lh+1μg/ml e2+24.2mg/l丙酮酸钠+100iu/ml青霉素+100μg/ml链霉素。
21、2)孤雌激活：将卵母细胞转入含有5μmol/l钙离子霉素的tcm-199中孵育，激活后彻底清洗。然后转入含有2mmol/l的6-dmap(n6,n6-二甲基氨基嘌呤)孵育2-3h，最后转入合成输卵管液(sof液)中培养。sof培养液成分如下：6.29g/l nacl+0.534g/l kcl+0.162g/lkh2po4+0.089g/l mgso4+0.299g/l cacl2.2h2o+2.1g/l nahco3+5.35mm乳酸钠+0.0357g/l丙酮酸钠+0.20mm谷氨酰胺+2％必需氨基酸混合液+1％非必需氨基酸混合液+4g/l bsa+100iu/ml青霉素+100iu/ml链霉素。
22、该技术方案通过添加tsa(曲古柳菌素a,trichostatin a)于体外胚胎培养液中培养10小时，再转入胚胎培养液中培养，显著提升绵羊卵母细胞的体外囊胚发育率(45.5％vs58.4％)。
23、现有技术二的缺点
24、存在的问题：
25、1)现有技术tsa添加方案，仅限于提高新鲜绵羊卵母细胞的孤雌囊胚发育，对于能否提高冷冻卵母细胞的胚胎发育，作者没有涉及，可不可行未知。
26、2)现有技术中tsa药物的使用多用于提高克隆胚的发育潜力，尽管现有技术通过tsa提升绵羊孤雌发育潜力，但对于正常胚胎发育而言添加此物可能是不友好的。卵母细胞或早期胚胎发育非常容易受到外界环境影响。通过模拟体内环境是促进卵母细胞成熟和体外胚胎的发育才是安全有效的方法。而且，添加tsa后，绵羊孤雌囊胚发育率为58.4％，仍较低。
技术实现思路
1、本本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法，其特征在于，步骤4中，解冻液已于恒温台上升温至38.5℃。
3.根据权利要求1所述的提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法，其特征在于，步骤7中的体外成熟培养液，解冻液,恢复液,孤雌发育液和体外胚胎培养液中均添加左旋肉碱和甜菜碱。
4.根据权利要求3所述的提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法，其特征在于，左旋肉碱浓度为2mmol/L和甜菜碱浓度为0.5mmol/L。
5.根据权利要求1所述的提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法，其特征在于，步骤7，基础液中TCM199含HEPES；检卵液中TCM199含HEPES；孤雌激活液A液中DPBS含钙镁。
【技术特征摘要】
1.一种提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法，其特征在于，步骤4中，解冻液已于恒温台上升温至38.5℃。
3.根据权利要求1所述的提高绵羊冷冻卵母细胞体外囊胚发育率的方法，其特征在于，步骤7中的体外成熟培养液，解冻液,恢复液,孤雌发育液和体外胚胎培养液中均...
【专利技术属性】
技术研发人员：周光斌，潘波，秦建鹏，杜昆霖，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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