【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种同时检测新型冠状病毒毒株及其变异株的引物探针组合、试剂盒和检测方法。
技术介绍
1、新型冠状病毒sars-cov-2是一种正义单链rna病毒，其复制和转录由病毒rna依赖性rna聚合酶(rdrp、nsp12)完成。在其rna复制过程中，经常会发生错误。由于这种主要受自然选择影响的快速进化，新变体的形成不是偶发，而是周期性有确定性发生。因此，自流行以来，已经出现了许多变种，并且一直持续出现到今天。截至2022年底，世界卫生组织(who)提出的“关切的变异株”(variantof concern,voc)有5个，分别为阿尔法(alpha)、贝塔(beta)、伽玛(gamma)、德尔塔(delta)和奥密克戎(omicron)。这些变异株在传播性、致病性或免疫逃逸能力方面显著增强。对于奥密克戎，又产生许多子变体，包括ba.1、ba.2、ba.3、ba.4、ba.5及其后代谱系，其中ba.5的传播速度更快，具有较强的免疫逃逸能力，而ba.5.2、bf.7和bq.1.1等亚分支及重组变异株(xbb.1)是奥密克戎ba.5变异株的亚系，相对于ba.5，它们的传播速度快、传染力强、代际间隔更短，极易造成大面积传播。
2、随着我国对外交流的不断增加，我国新冠病毒主要流行株的构成也受国际影响明显增大。从监测数据看，奥密克戎变异株的ba.5.2和bf.7仍是全国流行的绝对优势毒株，截至目前，根据中疾控公开资料统计，xbb系列变异株及eq.5也成为我国主要新冠病毒流行株(https://www.sohu
3、目前，快速准确的分子诊断是控制传染病的关键工具。现用于检测新型冠状病毒的分子技术有实时荧光定量pcr法、恒温扩增法、基因测序法和数字pcr法等。针对新型冠状病毒变异株的鉴别主要使用新一代测序方法，该方法虽能够通过对病毒基因序列的分析找出不同毒株的同源性，跟踪其突变情况，但其操作较复杂、数据分析难度大、检测成本较高、耗时长，不易实现快速检测。当下首推的检测手段依然是实时荧光定量pcr方法，但由于新型冠状病毒隐藏很深，存在病毒持续、少量存留的可能性，检测结果受到试剂盒灵敏度低的影响，极易导致假阴性。
4、因此，有必要开发一种快速、准确、高灵敏、低成本且适用当前流行新型冠状病毒5种主要变异株(ba.5.2、bf.7、xbb.1、bq.1.1以及eq.5)的分型检测方法，用于早期病毒检测及实时监测新型冠状病毒毒株的变异情况，对传染源进行追踪溯源，为动态评估疫苗对变异株的有效性提供依据。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种同时检测新型冠状病毒毒株及其变异株的引物探针组合、试剂盒和检测方法，可实现一次反应同时检测新型冠状病毒毒株及其5种主要变异株分型，操作简单、快速、成本低、特异性好、灵敏度高，解决了现有技术中单重荧光pcr需要单孔单检，步骤繁琐的问题。
2、本专利技术提供了一种同时鉴别新型冠状病毒毒株和变异株的引物探针组，包括针对新型冠状病毒株设计的核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物、seq id no.2所示的下游引物和seq id no.3所示的探针；
3、针对新型冠状病毒xbb.1变异株设计的核苷酸序列如seq id no.4所示的上游引物、seq id no.5所示的下游引物和seq id no.6所示的探针；
4、针对新型冠状病毒bf.7变异株设计的核苷酸序列如seq id no.7所示的上游引物、seq id no.8所示的下游引物和seq id no.9所示的探针；
5、针对新型冠状病毒bq.1.1变异株设计的核苷酸序列如seq id no.10所示的上游引物、seq id no.11所示的下游引物和seq id no.12所示的探针；
6、针对新型冠状病毒ba.5.2变异株设计的核苷酸序列如seq id no.13所示的上游引物、seq id no.14所示的下游引物和seq id no.15所示的探针；
7、针对新型冠状病毒eq.5变异株设计的核苷酸序列如seq id no.16所示的上游引物、seq id no.17所示的下游引物和seq id no.18所示的探针。
8、优选的，在每条探针上均标记有荧光基团和淬灭基团；
9、每条探针上标记不同的荧光基团。
10、优选的，所述荧光基团选自fam、hex、rox、cy5、cy5.5和amca中的任一种。
11、本专利技术提供了一种同时检测新型冠状病毒毒株和变异株的试剂盒，包括上述引物探针组，阳性质控品和阴性质控品。
12、优选的，还包括用于扩增内参基因的上游引物、下游引物和探针；所述扩增内参基因的上游引物的核苷酸序列如seq id no.19所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.20所示，探针的核苷酸序列如seq id no.21所示。
13、优选的，所述试剂盒中还包括用于构建多重实时荧光pcr反应体系的试剂。
14、优选的，所述试剂盒中各引物的浓度均为50～100μmol/l；各探针的浓度均为50～100μmol/l。
15、优选的，当所述试剂盒中为常温保存的冻干型时，还包括冻干保护试剂，所述冻干保护试剂包括以下浓度的组分：海藻糖80～120mg/ml、甘露醇0.3～1mg/ml、组氨酸5～15mg/ml、牛血清白蛋白0.1～1wt％、吐温-80 0.3～0.7wt％、叔丁醇0.5～1.5wt％、右旋糖苷-404～6mmol/l、pvp 0.3～0.8mg/ml和水解明胶0.3～0.8mg/ml，还包括carrier rna0.3～1wt％、紫衫酮1～5mg/ml、顺-二氯二铵合铂0.3～1.2wt％。
16、本专利技术还提供了一种非诊断目的的同时检测新型冠状病毒毒株和变异株的方法，包括以下步骤：利用上述引物探针组或上述试剂盒与样本核酸混合配制成多重实时荧光pcr反应体系，进行多重实时荧光pcr反应，根据荧光信号和扩增曲线判断所述样本中新型冠状病毒的有无和具体分型。
17、优选的，所述多重实时荧光pcr反应的程序，包括：45～50℃20min，1个循环；95～98℃3min，1个循环；95～98℃15s，50～60℃30s，35～45个循环，在退火延伸阶段读取荧光信号。
18、优选的，所述样本的扩增曲线呈典型s型曲线，且目的基因通道的ct≤40，判为阳性；
19、目的基因通道ct＞40或扩增曲线无明显对数增长期，内标对照ct≤40，判定对应目标结果为阴性或样本浓度低于本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时鉴别新型冠状病毒毒株及其变异株的引物探针组，其特征在于，包括针对新型冠状病毒毒株设计的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物和SEQ ID No.3所示的探针；
2.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，在每条探针上均标记有荧光基团和淬灭基团；每条探针上标记不同的荧光基团。
3.根据权利要求2所述引物探针组，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX、CY5、CY5.5和AMCA中的任一种。
4.一种同时检测新型冠状病毒毒株及其5种主要变异株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述引物探针组，阳性质控品和阴性质控品。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括用于扩增内参基因的上游引物、下游引物和探针；所述扩增内参基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.19所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于构
7.根据权利要求5或6所述试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒为常温保存的冻干型时，还包括冻干保护试剂，所述冻干保护试剂包括以下浓度的组分：海藻糖80～120mg/mL、甘露醇0.3～1mg/mL、组氨酸5～15mg/mL、牛血清白蛋白0.1～1wt％、吐温-80 0.3～0.7wt％、叔丁醇0.5～1.5wt％、右旋糖苷-404～6mmol/L、PVP 0.3～0.8mg/mL和水解明胶0.3～0.8mg/mL；
8.一种非诊断目的的同时检测新型冠状病毒毒株及其5种主要变异株的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求1～3任一项所述引物探针组或权利要求4～7任一项所述试剂盒与样本核酸混合配制成多重实时荧光PCR反应体系，进行多重实时荧光PCR反应，根据荧光信号和扩增曲线判断所述样本中新型冠状病毒株的有无和具体分型。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述多重实时荧光PCR反应的程序，包括：45～50℃20min，1个循环；95～98℃3min，1个循环；95～98℃15s，50～60℃30s，35～45个循环，在退火阶段读取荧光信号。
10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述样本的扩增曲线呈典型S型曲线，且目的基因通道的Ct≤40，判为阳性；
...【技术特征摘要】
1.一种同时鉴别新型冠状病毒毒株及其变异株的引物探针组，其特征在于，包括针对新型冠状病毒毒株设计的核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物、seq id no.2所示的下游引物和seq id no.3所示的探针；
2.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，在每条探针上均标记有荧光基团和淬灭基团；每条探针上标记不同的荧光基团。
3.根据权利要求2所述引物探针组，其特征在于，所述荧光基团选自fam、hex、rox、cy5、cy5.5和amca中的任一种。
4.一种同时检测新型冠状病毒毒株及其5种主要变异株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述引物探针组，阳性质控品和阴性质控品。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括用于扩增内参基因的上游引物、下游引物和探针；所述扩增内参基因的上游引物的核苷酸序列如seq idno.19所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.20所示，探针的核苷酸序列如seq id no.21所示。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于构建多重实时荧光pcr反应体系的试剂。
7.根据权利要求5或6所述试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘琪琦，侯广争，周喆，丁艳磊，刘晓美，曹鹏程，赵昶旭，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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