【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及小肠类器官培养，尤其涉及一种羊科小肠类器官培养基及其培养方法。
技术介绍
1、小肠是哺乳动物体内营养消化和吸收的主要器官。在人和小鼠等单胃动物研究中，可以使用细胞系和小肠类器官作为体外研究的模型，但是在反刍动物中尚缺乏相应的模型，因此难以开展相应的体外研究。
2、肠道类器官技术提供了一个优秀的体外研究模型，其包含几乎所有类型的肠上皮细胞，而且具有营养物质转运以及屏障等功能。基于类器官开展肠道上皮细胞功能研究和肠道疾病研究可减少实验动物的使用，大大节约实验经费。
3、羊科动物是重要的反刍家畜动物，其中又以绵羊和山羊作为最常见的饲养品种，因其体型适中而在反刍动物研究中广为应用。迄今为止，羊科动物的小肠类器官专用培养基尚未见有报道。仅有的一篇绵羊小肠类器官报道使用了公司的人小肠类器官专用培养基(文献号：pmc8456012)，根据其中结果显示，在此种培养条件下，小肠类器官仅能生长为球状体，无法萌发代表小肠绒毛结构的出芽。在专利技术人的实验中也证明了这一结论，即人类小肠类器官培养基在培养羊科动物小肠类器官时存在生长缓慢，结构不完整的现象，无法建立研究所需的模型。因此开发可以模拟肠道结构和细胞组成的羊科动物小肠类器官培养基有着现实且急迫的需要。
4、另一方面，绵羊和山羊存在生殖隔离，因此是羊科动物下的两种不同物种。正如前述(文献号：pmc8456012)所示，同一配方在培养不同物种来源的类器官时效果截然不同。因此针对绵羊和山羊的通用小肠类器官培养基配方的研发可以大大降低实验成本，拓展应用范
技术实现思路
1、专利技术目的：针对现有技术的不足与缺陷，本专利技术提供一种羊科小肠类器官培养基及其培养方法；培养基可促进羊科小肠各个肠段隐窝中的干细胞增殖分化，在体外形成类器官；还具有所用生长因子少、成本低、一致性高的优点。
2、技术方案：本专利技术的一种羊科小肠类器官培养基，其特征在于：在advanced dmem/f12培养基中添加n2补充剂、b27血清替代物、n-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、a83-01、sb202190、y27632、hepes、glutamax、青链霉素混合液、wnt3a、r-spondin1条件培养基、noggin、egf配制而成。
3、其中，每100ml所述的advanced dmem/f12培养基中添加1ml n2补充剂、2ml b27血清替代物、1.25mm n-乙酰半胱氨酸、10mm烟酰胺、500nm a83-01、10nm sb202190、10μmy27632、1ml hepes、1ml glutamax、1ml青链霉素混合液、10μg wnt3a、5ml r-spondin1条件培养基、10μg noggin、5μg egf。
4、其中，所述的advanced dmem/f12培养基为gibcotm公司生产的型号12634010的培养基。(pmc3969856)
5、其中，所述的r-spondin1条件培养基，包括体积百分比99％的advanced dmem/f12培养基与体积百分比1％的glutamax培养ha-r-spondin 1-fc 293t细胞的上清。r-spondin1条件培养基的制作方法参照cultrex ha-r-spondin1-fc 293t细胞(r&d，目录号：3710-001-01)说明书所述。
6、本专利技术的羊科小肠类器官培养方法，其特征在于：包括下述步骤：
7、1)从羊科动物小肠分离隐窝；
8、2)将羊科动物小肠隐窝培养成为类器官；
9、3)羊科动物肠道类器官的消化传代；
10、4)羊科动物肠道类器官的冻存；
11、5)羊科动物肠道类器官的复苏。
12、其中，所述的步骤1)包括下述步骤：
13、1)获取羊小肠各个肠段的样品，样品长4.5cm-5.5cm，将肠段剪开，使用含青链霉素的pbs将肠道内容物洗涤干净，刮除肠道内壁中的粘液及绒毛；
14、2)将清理干净的肠段剪碎，使用预冷的含青链霉素的pbs洗涤，加入10ml 2mmedta置于冰上消化45min；
15、3)静置使肠道碎片自然沉降，丢弃上清液，加入提前预冷的pbs摇晃使隐窝脱落，将隐窝悬液整体通过70μm滤网，900rpm离心3min收集隐窝。
16、其中，所述的步骤1)中，使用含3％青链霉素的pbs洗涤三次；所述步骤2)中，使用预冷的含1％青链霉素的pbs洗涤直至没有泡沫。
17、其中，所述的步骤2)包括下述步骤：
18、1)将羊科小肠类器官培养基与无生长因子的基质胶1:1混合，以500个隐窝/50μl接种于24孔板上；
19、2)将培养皿置于37℃培养箱放置20min，使基质胶凝固，随后加入600μl羊科小肠类器官培养基；
20、3)72h更新一次培养基，9d-11d后可见大量绒球状羊肠道类器官。
21、其中，所述的步骤3)包括下述步骤：
22、1)弃上清，加入预冷的pbs吹散基质胶；
23、2)900rpm离心3min，弃上清，使用tryple 37℃消化3min，加入等体积的羊科小肠类器官培养基终止消化；
24、3)24孔板每个孔以1000个单细胞接种；
25、4)重复步骤2)将羊科动物小肠隐窝培养成为类器官的操作，完成消化传代。
26、其中，所述的步骤4)的冻存时，采用的冻存液包括45％体积分数肠道类器官培养基+45％体积分数fbs+10％体积分数dmso。
27、有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下显著优点：本专利技术通过专利技术人大量的创造性劳动，创建了一种适用于多种羊科动物的全肠道的类器官培养液，并公开了建立类器官的方案。采用本专利技术的羊小肠类器官分离方法，通过此方法可以获得数量多且活力较好的隐窝。本专利技术所提供的羊小肠类器官培养基适用于羊科动物小肠各个肠段，即十二指肠、回肠、空肠，普适性较好，具有多物种适应性。本专利技术所提供的羊小肠类器官培养基成分组成简单，并且使用了r-spondin1条件培养基来替代r-spondin1生长因子，降低了试验成本。
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1.一种羊科小肠类器官培养基，其特征在于：在Advanced DMEM/F12培养基中添加N2补充剂、B27血清替代物、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、A83-01、SB202190、Y27632、HEPES、GlutaMax、青链霉素混合液、Wnt3a、R-spondin1条件培养基、Noggin、EGF配制而成。
2.根据权利要求1所述的羊科小肠类器官培养基，其特征在于：每100mL所述的Advanced DMEM/F12培养基中添加1mL N2补充剂、2mL B27血清替代物、1.25mM N-乙酰半胱氨酸、10mM烟酰胺、500nM A83-01、10nM SB202190、10μM Y27632、1mL HEPES、1mLGlutaMax、1mL青链霉素混合液、10μg Wnt3a、5mL R-spondin1条件培养基、10μg Noggin、5μg EGF。
3.根据权利要求1或2所述的羊科小肠类器官培养基，其特征在于：所述的AdvancedDMEM/F12培养基为GibcoTM公司生产的型号12634010的培养基。
4.根据权利要求
5.根据权利要求1所述的羊科小肠类器官培养方法，其特征在于：包括下述步骤：
6.根据权利要求5所述的羊科小肠类器官培养方法，其特征在于：所述的步骤1)包括下述步骤：
7.根据权利要求6所述的羊科小肠类器官培养方法，其特征在于：所述的步骤1)中，使用含3％青链霉素的PBS洗涤三次；所述步骤2)中，使用预冷的含1％青链霉素的PBS洗涤直至没有泡沫。
8.根据权利要求5所述的羊科小肠类器官培养方法，其特征在于：所述的步骤2)包括下述步骤：
9.根据权利要求5所述的羊科小肠类器官培养方法，其特征在于：所述的步骤3)包括下述步骤：
10.根据权利要求5所述的羊科小肠类器官培养方法，其特征在于：所述的步骤4)的冻存时，采用的冻存液包括45％体积分数肠道类器官培养基+45％体积分数FBS+10％体积分数DMSO。
...【技术特征摘要】
1.一种羊科小肠类器官培养基，其特征在于：在advanced dmem/f12培养基中添加n2补充剂、b27血清替代物、n-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、a83-01、sb202190、y27632、hepes、glutamax、青链霉素混合液、wnt3a、r-spondin1条件培养基、noggin、egf配制而成。
2.根据权利要求1所述的羊科小肠类器官培养基，其特征在于：每100ml所述的advanced dmem/f12培养基中添加1ml n2补充剂、2ml b27血清替代物、1.25mm n-乙酰半胱氨酸、10mm烟酰胺、500nm a83-01、10nm sb202190、10μm y27632、1ml hepes、1mlglutamax、1ml青链霉素混合液、10μg wnt3a、5ml r-spondin1条件培养基、10μg noggin、5μg egf。
3.根据权利要求1或2所述的羊科小肠类器官培养基，其特征在于：所述的advanceddmem/f12培养基为gibcotm公司生产的型号12634010的培养基。
4.根据权利要求1或2所述的羊...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄赞，朱海宁，秦静，宋明媚，朱伟云，毛胜勇，刘军花，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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