一种牦牛毛乳头细胞和毛母质细胞的分离方法技术

技术编号：40054380 阅读：12 留言：0更新日期：2024-01-16 21:42

本发明专利技术提供了一种牦牛毛乳头细胞和毛母质细胞的分离方法，属于细胞分离技术领域。本发明专利技术用3～4日龄天祝白牦牛的肩胛部皮肤组织作为初始分离原料，用中性蛋白酶处理皮肤组织后，拔出毛囊，剥离毛球，进一步利用胰蛋白酶进行消化，并在培养基中添加有益于细胞生长的细胞生长因子IGF和EGF，最终成功分离出了牦牛毛乳头细胞和毛母质细胞，为后续探究两种细胞在牦牛毛囊生长发育中的作用和两种细胞间互作的分子机制奠定了基础。

全部详细技术资料下载

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞分离，尤其涉及一种牦牛毛乳头细胞和毛母质细胞的分离方法。

技术介绍

1、毛囊主要由真皮层和表皮层构成，其中毛乳头细胞(dpcs)属于真皮层，是毛囊的“信号中心”，它们通过分泌诸多生长因子和细胞因子等信号分子控制着毛囊表皮层细胞的增殖和分化。毛母质细胞(hmcs)属于表皮层，是形成毛发各类细胞的前体细胞，它们是在毛囊干细胞被激活后迁移到毛囊毛球部所形成的细胞群体，其快速增殖和终末分化最终形成持续不断生长的毛发。牦牛生活在海拔较高的高原地区，能够适应高寒环境。牦牛毛乳头细胞和毛母质细胞之间的相互作用调节毛干的再生和脱落，使牦牛毛囊呈季节性周期发育。牦牛毛囊的季节性发育在其适应高寒恶劣环境方面具有重要意义。为进一步探究牦牛毛囊周期发育的分子机制及牦牛被毛皮肤对高寒环境的适应机理，需要对牦牛皮肤真皮毛乳头细胞和表皮毛母质细胞进行分离培养。

2、目前其他物种分离毛乳头细胞的方法主要有酶消化法和显微解剖法。酶消化法是将采集的皮肤组织剪去表皮层和皮下结缔组织，将剩余组织剪碎后，加入i型胶原酶进行消化；显微解剖法是使用胶原酶或中性蛋白酶将皮肤组织消化后，在体视显微镜下拔取毛囊进行毛囊细胞的分离培养。但与其他物种的皮肤相比，牦牛皮肤较厚，角质化程度高，韧性强，真皮层具丰富的胶原纤维，毛囊细胞贴壁困难，用常规的方法难以分离牦牛毛乳头细胞和毛母质细胞。

技术实现思路

1、有鉴于此，为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种牦牛毛乳头细胞和毛母质细胞的分离方法。

<p>2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：

3、本专利技术提供了一种牦牛毛乳头细胞的分离方法，包括以下步骤：

4、(1)取3～4日龄天祝白牦牛的皮肤，剪成2.5～3.5mm×4.5～5.5mm的长条，加入浓度为0.2～0.3％的中性蛋白酶溶液，消化1.5～2.5h；

5、(2)消化结束后，在体式显微镜下，剪去脂肪层，暴露处毛囊底部的真皮凝集层，反向拔出主要为毛乳头的毛球部分，用浓度为0.2～0.3％的胰蛋白酶消化毛球，所述消化的时间为18～23min；

6、(3)加入完全培养基于36～38℃，4～6％co2细胞培养箱进行培养，23～25h后补充一次完全培养基；

7、(4)待贴壁的毛乳头细胞迁移出来后，更换新的完全培养基；待细胞生长至汇合度度达到70～90％时，用0.2～0.3％的胰蛋白酶消化1.5～2.5min，用完全培养基重悬细胞，进行第一离心，弃上清液，用pbs溶液重悬细胞沉淀，进行第二离心，加入完全培养基混合制备细胞悬液，将细胞悬液转入新的培养瓶加入完全培养基继续培养8～10h，得到原代牦牛毛乳头细胞。

8、优选的，所述完全培养基为添加10％fbs，10ng/ml的igf，20ng/ml的egf，1％的青链霉素的dmem/f12培养基。

9、优选的，所述中性蛋白酶、胰蛋白酶的消化温度独立地为36～38℃。

10、优选的，所述第一离心的转速为700～900rpm，所述第一离心的时间为3～5min；所述第二离心的转速为700～900rpm，所述第二离心的时间为3～5min。

11、优选的，所述细胞悬液中的细胞密度为1×105～3×105个/ml，所述细胞悬液与完全培养基的体积比为：1:4～6。

12、本专利技术还提供了根据所述的分离方法制备得到的牦牛毛乳头细胞。

13、本专利技术还提供了一种牦牛毛母质细胞的分离方法，包括以下步骤：

14、(1)取3～4日龄牦牛的皮肤，剪成2.5～3.5mm×4.5～5.5mm的长条，加入浓度为0.2～0.3％的中性蛋白酶溶液，消化1.5～2.5h；

15、(2)消化结束后，拔出毛囊，剪下毛囊的毛球部分，用浓度为0.2～0.3％的胰蛋白酶消化毛球，所述消化的时间为18～23min；

16、(3)弃去胰蛋白酶消化液，加入完全培养基于36～38℃，4～6％co2进行培养，23～25h后补充一次完全培养基；

17、(4)待贴壁的毛母质细胞迁移出来后，更换新的完全培养基，此时的毛母质细胞会混有毛乳头细胞；待细胞生长至汇合度度达到70～90％时，用0.2～0.3％的胰蛋白酶消化1.5～2.5min，弃去含有毛乳头细胞的消化液，用0.2～0.3％的胰蛋白酶继续消化4～6min，加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入新的完全培养基继续培养18～24h，得到牦牛毛母质细胞。

18、优选的，通过胰蛋白酶差消化法纯化毛母质细胞，所述完全培养基为添加10％fbs，10ng/ml的igf，20ng/ml的egf，1％的青链霉素的dmem/f12培养基。

19、优选的，所述细胞悬液中的细胞密度为1×105～3×105个/ml，所述细胞悬液与完全培养基的体积比为：1:4～6。

20、本专利技术还提供了所述的分离方法得到的牦牛毛母质细胞。

21、通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术用3～4日龄牦牛的肩胛部皮肤组织作为分离原料，用中性蛋白酶处理皮肤组织后，拔出毛球和毛囊，进一步利用胰蛋白酶进行消化，并在培养基中添加有益于细胞生长的细胞生长因子igf和egf，最终成功分离出了牦牛毛乳头细胞和毛母质细胞，为后续探究两种细胞在牦牛毛囊周期发育中的作用和两种细胞互作的分子机制奠定了基础。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种牦牛毛乳头细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述完全培养基为添加8～12％FBS，8～12ng/mL的IGF，18～22ng/mL的EGF，0.8～1.2％的青链霉素的DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述中性蛋白酶、胰蛋白酶的消化温度独立地为36～38℃。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述第一离心的转速为700～900rpm，所述第一离心的时间为3～5min；所述第二离心的转速为700～900rpm，所述第二离心的时间为3～5min。

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述细胞悬液中的细胞密度为1×105～3×105个/mL，步骤(4)中所述细胞悬液与完全培养基的体积比为：1:4～6。

6.根据权利要求1所述的分离方法制备得到的牦牛毛乳头细胞。

7.一种牦牛毛母质细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，通过胰蛋白酶差

9.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，所述细胞悬液中的细胞密度为1×105～3×105个/mL，所述细胞悬液与完全培养基的体积比为：1:4～6。

10.根据权利要求7所述的分离方法制备得到的原代牦牛毛母质细胞。

...

【技术特征摘要】

1.一种牦牛毛乳头细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述完全培养基为添加8～12％fbs，8～12ng/ml的igf，18～22ng/ml的egf，0.8～1.2％的青链霉素的dmem/f12培养基。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述中性蛋白酶、胰蛋白酶的消化温度独立地为36～38℃。

5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述细胞悬液中的细胞密度为1×105～3×105个/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：张哓兰，胡江，赵志东，石斌刚，刘婷，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人