【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，特别是预防和/或治疗与过度的tnfα和/或il-6活性相关的疾病的领域。具体而言，本专利技术涉及特异性结合tnfα和il-6r，或tnfα和il-6的重组蛋白。
技术介绍
1、自身免疫性疾病作为继心血管疾病、癌症后威胁人类健康的第三大杀手，也被列入我国十类重大疾病。自身免疫是指机体免疫系统对自身组织细胞所发生的免疫应答的现象。当机体免疫系统对自身组织细胞发生免疫应答而造成细胞的破坏或组织的损伤并出现临床症状时，则称为自身免疫性疾病。目前发现的自身免疫性疾病有30多种，包括类风湿性关节炎(ra)、胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化症、红斑狼疮、银屑病、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、重症肌无力、多发性肌炎、皮肌炎、crohn病、自身免疫性血细胞减少、血管炎、系统性红斑狼疮等。
2、类风湿性关节炎的治疗涉及多种遗传和环境因素，治疗效果因此不同，导致对所有患者完全缓解的治疗有效是非常困难。很多用于治疗ra的新药物特别是生物制剂有助于带来治疗革命性进步。
3、类风湿性关节的发病涉及许多促炎细胞因子，特别是肿瘤坏死因子α(tnfα)和白细胞介素-6(il-6)。
4、tnfα活化t细胞并诱导t细胞浸润和新血管生成，通过增加成纤维细胞样滑膜细胞(fls)的增殖导致关节破坏破骨细胞的形成。il-6引起b细胞增殖并产生抗体，并诱导分化的t细胞分泌成il-17分泌性t辅助细胞(th17)，从而抑制调节性t细胞分化。
5、il-6能刺激血管生成和破骨细胞生成。il-6可与il-6r特
6、当类风湿关节炎病人接受il-6受体(il-6r)的单克隆抗体药物tocilizumab(actemra，roche)治疗后，病情得到明显缓解，更进一步证明了il-6在类风湿性节炎中的重要作用。
7、对现有临床结果进行综合比较发现，il-6通路抑制剂，包括已上市的tocilizumab和在研品种，无论其靶点是il-6，还是il-6r，其临床效果相当，且不良反应率也没有明显差异。许多病人对tnf抑制药物响应不足或长期使用后效果下降，tocilizumab的多项iii期临床试验表明tnf抑制药物响应不足或治疗效果下降的病人使用tocilizumab可得到良好的治疗效果。
8、双特异性抗体(bsab)是一类具有双亲嗜性的组合抗体，通常是双价的(也有四价和六价的)，即有两条抗原结合臂，具有结合两种不同特异性抗原的功能。中国专利申请cn102112495a公开了一种特异性结合tnfα和il-6r的双特异性抗体dvd279和dvd280，其在抗体ch1和cl的n端依次连接针对tnfα和il-6r，或针对il-6r和tnfα的可变结构域，但其与抗tnfα亲本抗体和抗il-6r亲本抗体对相同抗原的ec50的比值分别高达149.2倍(亲本抗体对il-6r的ec50为1.42nm，dvd279对il-6r的ec50为211.9nm)和9.13倍(亲本抗体对tnfα的ec50为0.44nm，dvd280对tnfα的ec50为4.02nm)，也即该双特异性抗体的结合力明显差于亲本抗体，表明该双特异性抗体对一种抗原(tnfα或il-6r)的结合显著抑制了其对另一种抗原(il-6r或tnfα)的结合力，无法同时高效抑制tnfα和il-6r，难以保证治疗效果。
9、因此，对于自身免疫性疾病或急慢性炎性疾病等疾病仍有未满足的需求，发展创新的、能更为有效、且副作用更小的治疗方法和药物是迫切而必要的。
技术实现思路
1、在本申请中，专利技术人通过大量的研究开发了一种双特异性结合tnfα和il-6r，或tnfα和il-6的重组蛋白，编码重组蛋白的核酸分子，包含核酸分子的载体，制备重组蛋白的方法，包含重组蛋白的药物组合物，药物组合物的在制备药物中的用途，重组蛋白在诊断/治疗/预防与过度的tnfα和il-6活性相关的疾病(例如炎性疾病或自身免疫性疾病)中的用途或方法，以及包含重组蛋白的试剂盒。
2、重组蛋白
3、因此，在一个方面，本专利技术提供了一种重组蛋白，其包含：
4、1)特异性结合第一抗原的第一抗体，所述第一抗体包括重链(hc)和轻链(lc)；和
5、2)特异性结合第二抗原的包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的抗体片段(例如fv，scfv，di-scfv)；
6、其中，所述抗体片段连接于第一抗体的重链或轻链的n端或c端；
7、所述第一抗原为tnfα，并且所述第二抗原为il-6r或il-6；或者，第一抗原为il-6r或il-6，并且所述第二抗原为tnfα。
8、在某些优选的实施方案中，所述抗体片段为scfv。
9、在某些优选的实施方案中，所述重组蛋白包含1个所述第一抗体和2个所述scfv；并且，所述第一抗体包括两条hc和两条lc，其中所述第一抗体的一条hc的重链可变区(vh)与一条lc的轻链可变区(vl)形成抗原结合部位，另一条hc的重链可变区(vh)与另一条lc的轻链可变区(vl)形成抗原结合部位。
10、在某些优选的实施方案中，每个所述scfv分别连接于所述第一抗体的两条重链或两条轻链的n端或c端。
11、在某些优选的实施方案中，每个所述scfv分别连接于所述第一抗体的两条重链的n端。在某些优选的实施方案中，每个所述scfv分别连接于所述第一抗体的两条重链的c端。
12、在某些优选的实施方案中，每个所述scfv分别连接于所述第一抗体的两条轻链的n端。在某些优选的实施方案中，每个所述scfv分别连接于所述第一抗体的两条轻链的c端。
13、在某些优选的实施方案中，一个所述scfv连接于所述第一抗体的重链或轻链的n端，另一个所述scfv连接于所述第一抗体的重链或轻链的c端。
14、在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链包含重链可变区(vh)和ch1结构域，并且所述轻链包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)。在此类实施方案中，所述第一抗体可以为fab片段、fab’片段或f(ab’)2片段。在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链包含重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)，并且所述轻链包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)。在此类实施方案中，所述第一抗体可以为全长抗体。
15、在某些优选的实施方案中，所述第一抗体的重链为igg同种型，例如igg1、igg2、igg3或igg4；优选为人igg同种型。在某些实施方案中，所述第一抗体的重链为人igg1同种型。在某些优选的实施方案中，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组蛋白，其包含：
2.权利要求1所述的重组蛋白，其中所述第一抗体的重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，并且所述轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)；
3.权利要求1或2所述的重组蛋白，其中所述第一抗体的重链为IgG同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，例如人IgG同种型；和/或，所述第一抗体的轻链为Kappa同种型，例如人Kappa同种型。
4.权利要求1-3任一项所述的重组蛋白，其中所述第一抗体的两条HC包含相同的CDR；和/或，所述第一抗体的两条LC包含相同的CDR；
5.权利要求1-4任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其中对于所述每条多肽链：
6.权利要求5所述的重组蛋白，其中所述接头S1和/或S2为肽接头，例如具有如(GmSn)x所示的氨基酸序列，其中m、n各自独立地选自1～8的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x独立地选自1～20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
7.权利要求1-6任一项所述的重组蛋白，其中所述scFv的VH与VL之间存在二硫键；
8.权利要求1-7任一项所述的重组蛋白，其中所述第一抗体特异性结合TNFα，并且所述scFv特异性结合IL-6R，其中：
9.权利要求8所述的重组蛋白，其中，所述重组蛋白包含1个所述第一抗体和2个所述scFv；并且，所述第一抗体包括两条HC和两条LC，其中所述第一抗体的一条HC的VH与一条LC的VL形成抗原结合部位，另一条HC的VH与另一条LC的VL形成抗原结合部位；每个所述scFv分别连接于所述第一抗体的两条重链的N端；且，
10.权利要求1-9任一项所述的重组蛋白，其中：所述第一抗体包含如SEQ ID NO:5所示的VH和如SEQ ID NO:1所示的VL；并且，所述scFv包含：
11.权利要求1-8任一项所述的重组蛋白，其中：所述第一抗体包含如SEQ ID NO:13所示的VH和如SEQ ID NO:9所示的VL；并且，所述scFv包含：
12.权利要求1-7任一项所述的重组蛋白，其中所述第一抗体特异性结合IL-6R，并且所述scFv特异性结合TNFα，其中：
13.权利要求1-7或12任一项所述的重组蛋白，其中：所述第一抗体包含如SEQ ID NO:21所示的VH和如SEQ ID NO:17所示的VL；并且，所述scFv包含：
14.权利要求1-7或12任一项所述的重组蛋白，其中：所述第一抗体包含如SEQ ID NO:29所示的VH和如SEQ ID NO:25所示的VL；并且，所述scFv包含：
15.权利要求1-14任一项所述的重组蛋白，其中所述第一抗体包含：如SEQ ID NO:101所示的CH；和/或，如SEQ ID NO:100所示的CL。
16.权利要求1-15任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包含：
17.权利要求1-16任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白对TNFα和IL-6R具有与其各自的亲本抗体相比同等或者更高的亲和力；
18.权利要求1-17任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白具有与亲本抗体相比基本相同的热稳定性。
19.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-18任一项所述的重组蛋白的核苷酸序列；
20.一种载体，其包含权利要求19所述的分离的核酸分子。
21.宿主细胞，其包含权利要求19所述的分离的核酸分子或权利要求20所述的载体。
22.制备权利要求1-18任一项所述的重组蛋白的方法，其包括，在允许所述重组蛋白表达的条件下，培养权利要求21所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述重组蛋白。
23.药物组合物，其含有权利要求1-18任一项所述的重组蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
24.权利要求1-18任一项所述的重组蛋白或权利要求23所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗与过度的TNFα和/或IL-6活性相关的疾病(例如炎性疾病或自身免疫性疾病)，和/或用于体外或在受试者(例如人)体内抑制TNFα和IL-6R的活性；
...【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其包含：
2.权利要求1所述的重组蛋白，其中所述第一抗体的重链包含重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)，并且所述轻链包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)；
3.权利要求1或2所述的重组蛋白，其中所述第一抗体的重链为igg同种型，例如igg1、igg2、igg3或igg4，例如人igg同种型；和/或，所述第一抗体的轻链为kappa同种型，例如人kappa同种型。
4.权利要求1-3任一项所述的重组蛋白，其中所述第一抗体的两条hc包含相同的cdr；和/或，所述第一抗体的两条lc包含相同的cdr；
5.权利要求1-4任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其中对于所述每条多肽链：
6.权利要求5所述的重组蛋白，其中所述接头s1和/或s2为肽接头，例如具有如(gmsn)x所示的氨基酸序列，其中m、n各自独立地选自1～8的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x独立地选自1～20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；
7.权利要求1-6任一项所述的重组蛋白，其中所述scfv的vh与vl之间存在二硫键；
8.权利要求1-7任一项所述的重组蛋白，其中所述第一抗体特异性结合tnfα，并且所述scfv特异性结合il-6r，其中：
9.权利要求8所述的重组蛋白，其中，所述重组蛋白包含1个所述第一抗体和2个所述scfv；并且，所述第一抗体包括两条hc和两条lc，其中所述第一抗体的一条hc的vh与一条lc的vl形成抗原结合部位，另一条hc的vh与另一条lc的vl形成抗原结合部位；每个所述scfv分别连接于所述第一抗体的两条重链的n端；且，
10.权利要求1-9任一项所述的重组蛋白，其中：所述第一抗体包含如seq id no:5所示的vh和如seq id no:1所示的vl；并且，所述scfv包含：
11.权利要求1-8任一项所述的重组蛋白，其中：所述第一抗体包含如seq id no:13所示的vh和如seq id no:9所示的...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛彤彤，肖亮，郑勇，刘登念，崔亚敏，刘立平，王利春，王晶翼，
申请(专利权)人：四川科伦博泰生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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