【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因治疗领域，涉及一种用于治疗青光眼疾病的慢病毒样颗粒，尤其涉及一种适用于治疗青光眼疾病的经改造的慢病毒样颗粒vlp，通过vlp载体递送crispr/cas9 rnp的技术，体内敲除突变基因治疗poag。
技术介绍
1、青光眼是一种以视乳头凹陷扩大和视野缺损为特征的异质性疾病，是世界范围内导致不可逆转失明的最常见原因。在40-80岁人中青光眼患病率为3.54％(tham y-cet.al.global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burdenthrough 2040)，全球有超过六千万人患有青光眼。青光眼有先天性、原发性和继发性三大类型。青光眼疾病的诱因很多，包括遗传因素、年龄增长、过度用眼，高度近视和眼部受伤等，都能引起病理性眼压增高导致视神经损伤。现有研究表明，不管是哪种诱因和疾病亚型，普遍被接受的治疗方法是降低眼压，阻止视网膜胶质细胞死亡、视神经损伤，组织视力的持续丧失，但临床上目前没有根治青光眼的对因治疗的药物。
2、原发性青光眼又分为原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，poag)和原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,pacg)。其中原发性开角型青光眼是最常见的青光眼类型，全球患者占总人数的3.1％。降低眼压可缓解poag进程，降低眼压可通过局部用降眼压药、激光治疗或手术的方法进行。降眼压程度受视神经受损程度、个人眼压水平、危险因素和潜在
3、poag的发病与遗传因素相关，涉及到多种基因。myocilin基因(myoc)突变已被证明可导致poag，并表现出常染色体显性遗传，存在myocilin基因(myoc)功能获得性突变的患者占总患者比例约4％。目前已鉴定出近100种不同致病性myoc突变，其中大多数集中在外显子3上，编码嗅质蛋白(olfactomedin)结构域(c-端)的基因。myocilin蛋白是一种分泌蛋白，在眼部组织视网膜、睫状体和小梁网，以及骨骼肌、心脏、大脑和睾丸中都有表达。小梁网细胞内myocilin蛋白分泌至胞外，基因突变时分泌受阻，在胞内异常聚集，激活未折叠蛋白级联反应和内质网应激反应，诱发细胞凋亡，导致眼压相关基因bip,calnexin,pdi,atf4和chop表达上调，眼压升高。减少突变myocilin蛋白分泌是一种可行的治疗策略，眼组织内myocilin蛋白敲除不影响眼健康。随着基因治疗的发展，基因敲除术逐渐成熟，应用crispr/cas9技术在体敲除突变基因有希望根治基因突变疾病。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供解决现有技术中治疗单基因突变型青光眼安全性与有效性问题，提供一种用于治疗青光眼疾病的慢病毒样颗粒。具体的，这种治疗方法是基因编辑治疗方法，由vlp递送crispr/cas9 rnp靶向敲除眼球内小梁网组织中myoc基因实现的。
2、具体而言，本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
3、<第一方面>
4、本专利技术涉及一种慢病毒样颗粒，所述慢病毒样颗粒由vlp载体与cas9蛋白和靶向myoc基因的grna组成的rnp复合体组成。该慢病毒样颗粒vlp构成是：改造的慢病毒外壳，包裹了cas9蛋白和具有靶向性的grna组成的rnp复合体。改造的慢病毒外壳是将rna结合蛋白与慢病毒gagpol长链蛋白融合后包装成的慢病毒外壳。
5、作为本专利技术的一个实施方案，表达vlp载体成分的基因序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、④辅助质粒prsv-rev、⑤表达形成rnp所需cas9蛋白的质粒和⑥表达含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna质粒上。
6、作为本专利技术的一个实施方案，表达vlp载体成分的基因序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、④辅助质粒prsv-rev、⑤表达形成rnp所需cas9蛋白和含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna质粒上。
7、作为本专利技术的一个实施方案，vlp载体成分中膜蛋白包括表达vsv-g、cd4识别蛋白、cd8识别蛋白、rd114或狒狒内源逆转录病毒膜蛋白。
8、作为本专利技术的一个实施方案，vsv-g的氨基酸序列为seq id no.6。
9、作为本专利技术的一个实施方案，含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的氨基酸序列为seq id no.7。
10、作为本专利技术的一个实施方案，含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna骨架序列为seq id no.8。
11、作为本专利技术的一个实施方案，靶向myoc基因的grna上所携带的向导序列的靶向位点可以是myoc基因上的任意位点。vlp携带1种cas9:grna复合体的vlp靶向myoc基因产生indel(插入/缺失)，发生移码突变，敲除突变myoc基因。
12、作为本专利技术的一个实施方案，靶向myoc基因的grna序列分别为grna1：5’-ggcctccaggtctaagcgtt-3’，grna2：5’-tggccacactgaaggtatac-3’，grn a3：5’-caggacagctcagctcagga-3’，或grna4：5’-gggccaggacagctca gctc-3’。
13、<第二方面>
14、本专利技术涉及一种前述慢病毒样颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：将含有慢病毒载体基因组序列的质粒转染入病毒生产细胞，(收取上清液浓缩、纯化)制备而得；所述慢病毒载体基因组序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、④辅助质粒prsv-rev，以及⑤表达形成rnp所需cas9蛋白的质粒和⑥表达myoc grna的含rna结合蛋白所识别的rna本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种慢病毒样颗粒，其特征在于，所述慢病毒样颗粒由VLP载体与Cas9蛋白和靶向MYOC基因的gRNA组成的RNP复合体组成。
2.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，表达VLP载体成分的基因序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、④辅助质粒pRSV-Rev、⑤表达形成RNP所需Cas9蛋白的质粒和⑥表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的gRNA质粒上。
3.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，表达VLP载体成分的基因序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、④辅助质粒pRSV-Rev、⑤表达形成RNP所需Cas9蛋白和含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的gRNA质粒上。
4.根据权利要求2或3所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，VLP载体成分中膜蛋白包括表达VSV-G、CD4识别蛋白、CD8识别蛋白、RD114或狒狒内源逆转录病毒膜蛋白；V
5.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.7；含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的gRNA骨架序列为SEQ ID NO.8。
6.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，靶向MYOC基因的gRNA序列分别为gRNA1：5’-GGCCTCCAGGTCTAAGCGTT-3’，gRNA2：5’-TGGCCACACTGAAGGTATAC-3’，gRNA3：5’-CAGGACAGCTCAGCTCAGGA-3’，或gRNA4：5’-GGGCCAGGACAGCTCAGCTC-3’。
7.一种根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：表达膜蛋白的质粒、表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、辅助质粒pRSV-Rev，与表达形成RNP所需Cas9蛋白的质粒和表达MYOC gRNA的含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的gRNA质粒，或与表达形成RNP所需Cas9蛋白以及MYOC gRNA的含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的gRNA质粒共转染进病毒生产细胞，收取上清液浓缩、纯化，即得。
8.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述表达MYOC gRNA的含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的gRNA质粒是将MYOC gRNA序列分别加入质粒pU6-Osp.gRNAMS2in的启动子和gRNA骨架之间构建而得。
9.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，表达形成RNP所需Cas9蛋白以及MYOC gRNA的含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的gRNA质粒，是将MYOCgRNA序列分别加入质粒pCas9-Osp.gRNAMS2in的启动子和gRNA骨架之间构建而得。
10.一种根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒在制备特异性靶向小梁网组织的药物中的用途，所述慢病毒样颗粒给药方式为前房注射。
11.一种根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒在制备治疗青光眼疾病的药物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种慢病毒样颗粒，其特征在于，所述慢病毒样颗粒由vlp载体与cas9蛋白和靶向myoc基因的grna组成的rnp复合体组成。
2.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，表达vlp载体成分的基因序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、④辅助质粒prsv-rev、⑤表达形成rnp所需cas9蛋白的质粒和⑥表达含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna质粒上。
3.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，表达vlp载体成分的基因序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、④辅助质粒prsv-rev、⑤表达形成rnp所需cas9蛋白和含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna质粒上。
4.根据权利要求2或3所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，vlp载体成分中膜蛋白包括表达vsv-g、cd4识别蛋白、cd8识别蛋白、rd114或狒狒内源逆转录病毒膜蛋白；vsv-g的氨基酸序列为seq id no.6。
5.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的氨基酸序列为seq id no.7；含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna骨架序列为seq id no.8。
6.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，靶向myoc基因的grna序列分别为grna1：5’-ggcctccaggtctaagcgtt-3’，grna2：5’-tggccac...
【专利技术属性】
技术研发人员：凌思凯，张琳，
申请(专利权)人：上海本导基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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