【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因治疗领域，涉及一种用于治疗亨廷顿疾病的慢病毒样颗粒，尤其涉及一种适用于治疗亨廷顿舞蹈病的经改造的慢病毒样颗粒vlp。
技术介绍
1、亨廷顿舞蹈病(huntington's disease,hd)是一种有精神障碍、认知障碍的有舞蹈样不自主运动特征的遗传性神经系统疾病。亨廷顿为常染色体显性遗传病，患者的4号常染色体上的htt基因外显子1上cag核苷酸重复增加诱导的疾病。htt基因产物htt蛋白在人类神经元中广泛表达，具有多种功能。健康人中，htt基因中平均有17-20个cag重复。当cag重复次数达到40次以上时，形成多聚谷氨酰胺(polyq)，导致形成的亨廷顿蛋白聚集。聚集蛋白进入细胞核引起基因转录失调，聚集蛋白在细胞质破坏蛋白质稳态，包括突触功能障碍，线粒体毒性和轴突转运率降低，导致亨廷顿疾病发生。hd患者的一般在中年出现认知和运动障碍，随着年龄的增长增加。
2、全世界hd患病率约为2.7/10万，在西方国家中，hd的患病率为每10万人10.6-13.7人。目前临床上的治疗方式为对症治疗，而没有对因治疗的方法。随着基因治疗技术的发展，基因突变引起的遗传性疾病有了对因治疗的可能。近期，一项应用aav载体递送microrna(raav5-mihtt)敲低突变htt(mhtt)基因的疗法amt-130被提出应用于亨廷顿疾病治疗，ii期临床试验(nct05243017)正在进行中，在欧洲早期亨廷顿成年患者中考察amt-130的安全性和有效性。这种治疗方法治疗策略是应用aav载体在神经元内长期表达靶向mhtt
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供解决现有技术中治疗亨廷顿舞蹈病安全性与有效性问题，提供一种用于治疗亨廷顿疾病的慢病毒样颗粒。具体的，这种治疗方法是基因编辑治疗方法；是由vlp递送crispr rnp靶向敲除htt基因实现的。
2、具体而言，本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
3、<第一方面>
4、本专利技术涉及一种慢病毒样颗粒，所述慢病毒样颗粒由vlp载体与cas9蛋白和靶向htt基因的grna组成的rnp复合体组成。该慢病毒样颗粒vlp构成是：改造的慢病毒外壳，包裹了cas9蛋白和具有靶向性的grna组成的rnp复合体。改造的慢病毒外壳是将rna结合蛋白与慢病毒gagpol长链蛋白融合后包装成的慢病毒外壳。
5、作为本专利技术的一个实施方案，表达vlp载体成分的基因序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、④辅助质粒prsv-rev、⑤表达形成rnp所需cas9蛋白的质粒和⑥表达含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna质粒上。
6、作为本专利技术的一个实施方案，表达形成rnp所需cas9蛋白的质粒和表达含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna质粒可以为同一个质粒。即，表达vlp载体成分的基因序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、④辅助质粒prsv-rev、⑤表达形成rnp所需cas9蛋白和含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna质粒上。
7、作为本专利技术的一个实施方案，vlp载体成分中膜蛋白包括表达vsv-g、cd4识别蛋白、cd8识别蛋白、rd114、狒狒内源逆转录病毒膜蛋白或经过改造的有细胞感染特异性的膜蛋白。
8、作为本专利技术的一个实施方案，vsv-g的氨基酸序列为seq id no.7。
9、作为本专利技术的一个实施方案，经过改造的有细胞感染特异性的膜蛋白，即nvr-g蛋白，具有神经元感染特异性，nvr-g的氨基酸序列为seq id no.8。
10、作为本专利技术的一个实施方案，nvr-g的基因序列为seq id no.29。
11、作为本专利技术的一个实施方案，含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的氨基酸序列为seq id no.9。
12、作为本专利技术的一个实施方案，含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna骨架序列为seq id no.10。
13、作为本专利技术的一个实施方案，靶向htt基因的grna上所携带的向导序列的靶向位点可以是htt基因上的任意位点。携带1种cas9:grna复合体的vlp靶向突变htt(mhtt)基因产生indel(插入/缺失),发生移码突变，敲除突变htt(mhtt)基因；携带2种cas9:grna复合体的vlp靶向htt基因分别在cag重复序列的两端，切断cag重复序列，防止产生引起聚集的蛋白。
14、作为本专利技术的一个实施方案，靶向htt基因的grna序列为：
15、grna1：5’-ggccttcatcagcttttcca-3’、
16、grna4：5’-gaaggacttgagggactcga-3’、
17、grna7:5’-gaccctggaaaagctgatga-3’、
18、grna8:5’-ggagaccgccatggcgaccc-3’、
19、grna9:5’-cagcttttccagggtcgcca-3’、
20、grna10:5’-cttttccagggtcgccatgg-3’
21、或grna11:5’-aggccttcatcagcttttcc-3’。
22、作为本专利技术的一个实施方案，靶向htt基因的grna序列分别选择以下序列中的至少两种：
23、grna1：5’-ggccttcatcagcttttcca-3’、
24、grna2：5’-tgaggaagctgaggaggcgg-3’、
25、grna3：5’-ggcggcggctgaggaagctg-3’、
26、grna4：5’-gaaggacttgagggactcga-3’、
27、grna5：5’-ttcattgccccggtgctgag-3’、
28、grna6：5’-ggctgaggaagctgaggagg-3’、
29、grna7:5’-gaccctggaaaagctgatga-3’、
30、grna8:5’-ggagaccgccatggcgaccc-3’、
31、grna9:5’-cagcttttccagggtcgcca-3’、
32、grna10:5’-cttttccagggtcgccatgg-3’、
33、grna11:5’-aggccttcatcagcttttcc-3’、
34、grn本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种慢病毒样颗粒，其特征在于，所述慢病毒样颗粒由VLP载体包裹Cas9蛋白和靶向HTT基因的gRNA组成的RNP复合体组成。
2.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，表达VLP载体成分的基因序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、④辅助质粒pRSV-Rev、⑤表达形成RNP所需Cas9蛋白的质粒和⑥表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的gRNA质粒上。
3.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，VLP载体成分中膜蛋白包括表达VSV-G、CD4识别蛋白、CD8识别蛋白、RD114、狒狒内源逆转录病毒膜蛋白或经过改造的有细胞感染特异性的膜蛋白；VSV-G的氨基酸序列为SEQ ID NO.7；经过改造的有细胞感染特异性的膜蛋白，即NVR-G蛋白，具有神经元感染特异性，NVR-G的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。
4.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的氨基酸序列为SEQ ID
5.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，靶向HTT基因的gRNA上所携带的向导序列的靶向位点是HTT基因上的任意位点。
6.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，靶向HTT基因的gRNA序列为gRNA1：5’-GGCCTTCATCAGCTTTTCCA-3’、
7.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，靶向HTT基因的gRNA序列分别选择以下序列中的至少两种：
8.根据权利要求7所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，靶向HTT基因的gRNA质粒为gRNA1、gRNA4、gRNA5、gRNA7-12中的至少一种与gRNA2、gRNA3、gRNA6、gRNA13-18中至少一种的质粒组合。
9.一种根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：表达膜蛋白的质粒、表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、辅助质粒pRSV-Rev，与表达形成RNP所需Cas9蛋白的质粒和表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的HTT gRNA的质粒，或与表达形成RNP所需Cas9蛋白和含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的HTT gRNA质粒共转染进病毒生产细胞，收取上清液浓缩、纯化，即得。
10.一种根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒在制备治疗亨廷顿疾病的药物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种慢病毒样颗粒，其特征在于，所述慢病毒样颗粒由vlp载体包裹cas9蛋白和靶向htt基因的grna组成的rnp复合体组成。
2.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，表达vlp载体成分的基因序列分别位于①表达膜蛋白的质粒、②表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、③表达慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、④辅助质粒prsv-rev、⑤表达形成rnp所需cas9蛋白的质粒和⑥表达含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna质粒上。
3.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，vlp载体成分中膜蛋白包括表达vsv-g、cd4识别蛋白、cd8识别蛋白、rd114、狒狒内源逆转录病毒膜蛋白或经过改造的有细胞感染特异性的膜蛋白；vsv-g的氨基酸序列为seq id no.7；经过改造的有细胞感染特异性的膜蛋白，即nvr-g蛋白，具有神经元感染特异性，nvr-g的氨基酸序列为seq id no.8。
4.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的氨基酸序列为seq id no.9；含rna结合蛋白所识别的rna茎环结构的grna骨架序列为seq id no.10。
5.根据权利要求1所述的慢病毒样颗粒，其特征在于，靶向htt基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：凌思凯，张琳，
申请(专利权)人：上海本导基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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