重组慢病毒载体的纯化制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组慢病毒载体的纯化制备方法；包括粗病毒液收获、第一次核酸酶消化、深层过滤、TFF浓缩换液、第二次核酸酶消化和层析纯化步骤；TFF浓缩换液步骤中，采用中空纤维膜将深层过滤后的粗病毒液浓缩，使用缓冲液将浓缩粗病毒液洗滤至原始粗毒液的1/10

【技术实现步骤摘要】
重组慢病毒载体的纯化制备方法


[0001]本专利技术属于慢病毒载体纯化
，涉及一种重组慢病毒载体的纯化制备方法。

技术介绍

[0002]当前，在慢病毒纯化方面，通常是在20mM Tris缓冲液体系下，使用300kDa
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500kDa截流孔径对病毒液进行超滤浓缩换液。浓缩后的病毒液使用50U/ml核酸酶进行消化，消化条件为8℃过夜。消化后的慢病毒载体粗液进行层析纯化，层析包括两步，第一步进行复合模式树脂层析纯化(Capto Core 300)，随后进行一步阴离子交换层析精纯(Capto DEAE)。精纯回收的慢病毒载体进行300kDa
‑
500kDa第二次超滤浓缩换液，最后在0.2μm滤膜下过滤除菌后获得最终产品。该方案存在慢病毒回收率低，回收后慢病毒活性差的问题。
[0003]慢病毒的纯化流程包括了深层过滤、TFF浓缩、层析、二次TFF浓缩的过程。每个过程的进行都对最终的纯化回收率来说是一个重大的考验。每一步的过程都需要将单步的病毒损失量降至最低，这样才能够保证最终的慢病毒回收效率更高。
[0004]目前没有更加高效的纯化方法来对慢病毒进行纯化，因此现在更多的是在每一个流程的工艺细节上进行优化修改，使得纯化过程中的每一步的回收效率更高，进而一点一点将纯化的最终回收率提升上去。目前成熟的慢病毒回收工艺，已经将回收效率基本固定在了35％左右，往后的每1％的回收率提升都将是慢病毒纯化研究的重要一步。
[0005]慢病毒相比腺病毒更小，且更脆弱，在纯化过程中，pH、电导率、温度以及暴露时间都是导致慢病毒相对活性差的原因。在不影响慢病毒活性的情况下，选定的pH使得慢病毒和其他杂质蛋白的带电性相近，阴离子结合的情况相近，杂质较难分离，且回收率受到严重影响，而改变了pH后，慢病毒洗脱时所使用的盐浓度往往较高，这同样对慢病毒的活性造成严重影响。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供一种重组慢病毒载体的纯化制备方法。
[0007]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008]本专利技术涉及一种重组慢病毒载体的纯化制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0009]粗病毒液收获：对粗病毒液进行离心处理；
[0010]第一次核酸酶消化：对离心处理后的粗病毒液进行第一次核酸酶孵育；
[0011]深层过滤；
[0012]TFF浓缩换液：采用中空纤维膜将深层过滤后的粗病毒液浓缩，使用缓冲液将浓缩粗病毒液洗滤至原始粗毒液的1/10到1/20，得换液稀释后的浓缩病毒液；使用换液稀释后的浓缩病毒液对管路及中空纤维束膜柱进行反向循环清洗，收集，得到超滤浓缩换液后的病毒液；
[0013]第二次核酸酶消化：对超滤浓缩换液后的病毒液进行第二次核酸酶孵育；
[0014]层析纯化。
[0015]作为一个实施方案，所述离心处理采用低速离心，离心转速为2000
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3000g，离心温度为4
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8℃，离心时长为5
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10min。离心处理的目的在于去除一部分颗粒较大的杂质。在一些实施示例中，离心转速为2500g，离心温度为4℃，离心时长为5
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3min。
[0016]作为一个实施方案，所述第一次核酸酶孵育采用20
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30U/ml的核酸酶和2
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5mM DTT溶液孵育。第一次核酸酶孵育将较大的核酸分解成小片段，并在后续的TFF&层析中将其去除。在一些实施示例中，第一次核酸酶孵育采用25U/ml的核酸酶和2mM DTT溶液孵育。
[0017]进一步地，所述核酸酶选用ArcticZymes或西美杰，孵育温度为30
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33℃，孵育时长为0.5
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1h。在一些实施示例中，孵育温度为33℃，孵育时长为1h。
[0018]作为一个实施方案，所述深层过滤采用孔径为0.45μm滤膜进行过滤。虽然经过离心，但粗病毒液中仍然存在大颗粒的杂质，如少量的细胞碎片等，为了不然这些大颗粒杂质对纯化过程产生负面影响，本专利技术在进行TFF前，对粗病毒液进行深层过滤处理。
[0019]深层过滤操作时，使用蠕动泵将病毒液缓慢泵过滤膜，并进行收集，蠕动泵转速为30
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60rpm/min。
[0020]作为一个实施方案，所述缓冲液含Hapes、NaCl的组氨酸
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AC缓冲液，缓冲液pH＝3.0
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3.4。反向循环清洗的时间为10
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30min。TFF浓缩换液用以去除粗毒液中一部分小分子杂质，例如核酸片段、BSA等。提前对缓冲液buffer进行4℃预冷，保证在换液时，buffer温度能够保持低温状态。组氨酸
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AC缓冲液中含Hapes 10mM、NaCl 150mM。在一些实施示例中，本专利技术在TFF浓缩换液工序中使用的纯化缓冲体系为20mM组氨酸缓冲液体系(20mM组氨酸
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AC缓冲液，pH＝3.0,10mM Hapes)
[0021]作为一个实施方案，所述TFF浓缩换液步骤中，反向循环清洗后采用稀释缓冲液对管路及中空纤维束膜柱进行反向循环清洗，合并收集；所述缓冲液的体积为收集病毒液体积的1/4～1/3。
[0022]作为一个实施方案，所述第二次核酸酶孵育采用50
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100U/ml的核酸酶和2
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5mM DTT溶液孵育。第二次核酸酶孵育的目的是为了将残留在病毒液中的核酸完全去除。在一些实施示例中，第二次核酸酶孵育采用100U/ml的核酸酶和2mM DTT溶液孵育。
[0023]进一步地，所述核酸酶选用耐酸耐碱的核酸酶，孵育温度为30
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33℃，孵育时长为0.5
‑
1h。在一些实施示例中，孵育温度为33℃，孵育时长为1h。
[0024]作为一个实施方案，所述层析纯化采用复合模式层析，使用Capto Core 300或Viral L填料；单次上样量为3
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4CV。复合模式层析用以将病毒颗粒与其他杂质分离开来，最终达到精纯的目的。
[0025]作为一个实施方案，所述复合模式层析中，上样/层析流速为480cm/h，起始收集UV280为15mAU，终止收集UV280为15mAU。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0027]1)本专利技术更新了TFF浓缩换液工序，使目前的慢病毒纯化回收率提高至40％以上；新的TFF工艺关键步骤在于，浓缩结束后需要改变系统管路内的液体流动方向，将原本的正向循环清洗变更为反向的循环清洗，且反向的循环清洗必须满足30min以上，这样才能够保证最终的慢病毒回收效率。
[0028]2)本专利技术在两次核酸酶消化工序中均额外添加了核酸酶工作的辅助试剂，提高酶本身的工作效率。
附图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组慢病毒载体的纯化制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：粗病毒液收获：对粗病毒液进行离心处理；第一次核酸酶消化：对离心处理后的粗病毒液进行第一次核酸酶孵育；深层过滤；TFF浓缩换液：采用中空纤维膜使用缓冲液将深层过滤后的粗病毒液洗滤浓缩至原始粗病毒液的1/10
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1/20，得换液稀释后的浓缩病毒液；使用换液稀释后的浓缩病毒液对管路及中空纤维束膜柱进行反向循环清洗，收集，得到超滤浓缩换液后的病毒液；第二次核酸酶消化：对超滤浓缩换液后的病毒液进行第二次核酸酶孵育；层析纯化。2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体的纯化制备方法，其特征在于，所述离心处理采用低速离心，离心转速为2000
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3000g，离心温度为4
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8℃，离心时长为5
‑
10min。3.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体的纯化制备方法，其特征在于，所述第一次核酸酶孵育采用20
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30U/ml的核酸酶和2
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5mM DTT溶液孵育。4.根据权利要求3所述的重组慢病毒载体的纯化制备方法，其特征在于，所述核酸酶选用ArcticZymes或西美杰，孵育温度为30
‑
37℃，孵育时长为0.5
‑
1h。5.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：方春钱，季鹏宇，张琳，谭本芳，谢尚坤，
申请(专利权)人：上海本导基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：