一种表达载体及构建和应用与DU145细胞系制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及重组人固醇O

【技术实现步骤摘要】
一种表达载体及构建和应用与DU145细胞系


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组人固醇O
‑
脂酰转移酶1表达载体、载体构建方法及表达方法。
技术背景
[0002]前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均很高，对男性的健康造成严重威胁。在我国，前列腺癌的年发病率呈逐年上升趋势。虽然早期诊断和治疗措施得以改善，但晚期前列腺癌患者预后仍较差。因此对前列腺癌发生发展机制的探索一直是科研工作者研究的焦点，对于提高肿瘤的诊断和治疗水平具有重要意义。
[0003]胆固醇是动物体内一种重要的分子，它既是细胞膜的重要组成部分也是很多固醇类激素的前体，同时也参与众多信号通路。细胞内的游离胆固醇过多对细胞有害，所以哺乳动物细胞进化出一套精细的机制来调节游离胆固醇的含量。细胞内过多的游离胆固醇会在内质网被酰基化，从而以疏水的胆固醇酯的形式储存起来，这一过程由固醇O
‑
酰基转移酶(SOAT)所催化。在人体内，SAOT由两个基因编码：SOAT1和SOAT2。SOAT1广泛表达于各种组织，而SOAT2主要表达于肝脏和消化道。大量工作提示SOAT是动脉粥样硬化、阿兹海默症和某些癌症等疾病的重要靶点。
[0004]固醇O
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酰基转移酶1(SOAT1)定位在内质网中，为9次穿膜蛋白，蛋白稳定性差，单纯高表达固醇O
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酰基转移酶无法在细胞中稳定表达。前列腺癌组织中普遍存在胆固醇酯大量蓄积，因此构建固醇O
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酰基转移酶1载体并在前列腺癌细胞中表达对研究前列腺癌发生发展机制有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种重组人固醇O
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脂酰转移酶1表达载体、载体构建方法及表达方法。
[0006]本专利技术针对固醇O
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脂酰转移酶1设计了合适的引物并扩增获得cDNA，并通过融合His6‑
strep
‑
EGFP标签构建了包含上述cDNA的慢病毒载体。具体经过固醇O
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脂酰转移酶1基因全长的获得，pCDH
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His6‑
strep
‑
EGFP
‑
固醇O
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脂酰转移酶1质粒构建，包装病毒，病毒侵染细胞，而后嘌呤霉素筛选，扩增后获得SOAT1稳定过表达的DU145细胞系。
[0007]本专利技术优点在于:(1)本专利技术针对固醇O
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酰基转移酶1构建了过表达慢病毒载体，通过效果试验证实本专利技术的慢病毒载体能够显著高表达固醇O
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酰基转移酶1蛋白表达量。鉴于固醇O
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酰基转移酶1为一种潜在的前列腺癌治疗靶点，因此本专利技术的构建的固醇O
‑
酰基转移酶1表达载体及稳定细胞株有助于研究固醇O
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酰基转移酶1在列腺癌发展中的作用机制。(2)本专利技术首次在前列腺癌细胞中稳定表达固醇O
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酰基转移酶1，该稳定细胞系有利于进一步研究前列腺癌的发生发展机制。
附图说明
[0008]图1：为cDNA经PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳的结果图；
[0009]图2：为融合His6‑
strep
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EGFP片段后的琼脂糖凝胶电泳的结果图；
[0010]图3：为真核表达载体pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
puro；
[0011]图4：为转染空载体和固醇O
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脂酰转移酶1表达质粒，DU145细胞中固醇O
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脂酰转移酶1的表达的western blot结果图；
[0012]图5：为侵染空载体和固醇O
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脂酰转移酶1表达载体病毒，DU145细胞中固醇O
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脂酰转移酶1的表达的western blot结果图；
[0013]图6：为侵染固醇O
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脂酰转移酶1表达载体病毒后DU145细胞免疫荧光结果图。
具体实施方式
[0014]现结合实例，对本专利技术做进一步说明。实例仅限于说明本专利技术，而非对本专利技术的限定。
[0015]实施例1重组人固醇O
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脂酰转移酶1表达载体的构建
[0016](1)在NCBI上获取人固醇O
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脂酰转移酶1的cDNA序列；所述的人固醇O
‑
脂酰转移酶1的CDS序列如序列表1中所示的核苷酸序列
[0017](2)设计引物对所述cDNA进行扩增，经凝胶电泳鉴定后回收目的片段；
[0018]正义链：ATGGTGGGTGAAGAGAAGAT
[0019]反义链：TCAAAACACGTAACGACAAG
[0020]引物由上海生工生物有限公司合成。对cDNA序列进行扩增的聚合酶链反应总反应体系为：模板DU145细胞的cDNA 1μl，正义链1μl，反义链1μl，2
×
ApexHF HS DNA Polymerase FL Master Mix 25μl(#AG12207，Accurate Biotechnology)，加ddH2O至50μl。反应条件为：94℃预变性1min；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸5min。聚合酶链反应产物经质量浓度1％琼脂糖凝胶电泳分析后，取1653bp左右处目的片段的条带进行割胶并使用胶回收试剂盒回收目的片段(#28704，Qiagen)。
[0021](3)设计引物在N端融合His6‑
strep
‑
EGFP片段
[0022]正义链：
[0023]ATTCTAGAGCTAGCGAATTCGCCACCATGCATCATCACCATCACCATAG
[0024]反义链：
[0025]GCCGCGGATCCGATTTAAATTCAAAACACGTAACGACAAG
[0026]据文献“Structural insights into the inhibition mechanism of human sterol O
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acyltransferase 1by a competitive inhibitor”报道，在SOAT1的N端加上His7‑
strep
‑
GFP片段可以使SOAT1稳定表达。引物由上海生工生物有限公司合成。融合标签片段His6‑
strep
‑
EGFP序列如序列表二(由上海生工生物有限公司合成)，融合片段序列如附录三，聚合酶链反应总反应体系为：(2)中回收DNA1μl，融合标签片段1μl，正义链1μl，反义链1μl，2
×
ApexHF HS DNA Poly本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人固醇O
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脂酰转移酶1表达载体，其特征在于，包括序列表1中所示的核苷酸序列(SOAT1)或序列表3中所示的核苷酸序列的质粒。2.根据权利要求1所述的重组人固醇O
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脂酰转移酶1表达载体，其特征在于，通过第一限制性内切酶EcoRI和第二限制性内切酶Smil双酶切pCDH
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CMV
‑
MCS
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EF1
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Puro质粒后插入序列表3中所示的核苷酸序列所获得的质粒。3.一种权利要求1或2所述的重组人固醇O
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脂酰转移酶1表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：设计引物，以DU145细胞的cDNA为模板，对所述人固醇O
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脂酰转移酶1的CDS序列进行扩增，回收目的片段SOAT1；所述人固醇O
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脂酰转移酶1的CDS序列(SOAT1)如序列表1中所示的核苷酸序列的所示；步骤2：合成His6‑
strep
‑
EGFP片段，设计引物通过PCR获得His6‑
strep
‑
EGFP
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SOAT1片段；步骤3：将所述目的片段His6‑
strep
‑
EGFP
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SOAT1与pCDH
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CMV
‑
MCS
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EF1
‑
Puro质粒进行同源...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，罗圆媛，秦望舒，耿鹏宇，林志坤，路鑫，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：