【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，具体涉及一种抗菌脂肽的制备方法。
技术介绍
1、马铃薯是世界第四大粮食作物，并在世界范围内广泛种植。由疮痂链霉菌引起的马铃薯疮痂病是一种严重影响马铃薯品质的世界性病害，被称为“马铃薯的癌症”，近年来在日本、韩国、北美、欧洲等地都被相继报道且逐年加重，越来越引起人们重视。马铃薯疮痂病是一种蔓延速度很快的土传病害，主要发生在中性至弱碱性土壤中，不仅严重降低了农作物的市场价值，还会造成很大的经济损失。
2、为满足日益增长的粮食需求，培育优质无病害的马铃薯是关键。当今化学农药被广泛用于马铃薯病害管理，这对生态环境产生了不良影响，不仅降低了农业的可持续性，降低土壤肥力，还会扰乱生态平衡，因此生物防治逐渐成为世界研究热点，利用土壤微生物的拮抗特性开发生防菌剂，可以实现土壤生态体系的改良和病害的防治，是绿色、环保、高效的防治手段。目前为止，没有专门针对马铃薯疮痂病的防治方法，人们无法通过单一的方法来控制这种普遍存在的病原菌，因此迫切需要寻找新的高效环保的方法来防治马铃薯疮痂病。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术的实施例提出了一种抗菌脂肽的制备方法，其包括以下步骤：
2、发酵、将甲基营养型芽孢杆菌sj80或sj81接种至培养基中培养3天，收集发酵液，离心，得发酵上清液；
3、萃取、将乙酸乙酯与所述发酵上清液等比例混合，静置12h后，收集上层有机相，将剩余发酵上清液再加等比例的乙酸乙酯重新萃取，重复操作3次，将萃取得到的提取液真
4、分离纯化、以马铃薯疮痂链霉菌为指示菌，将sj80粗提物经第一次rp-c18硅胶柱层析分离、第二次rp-c18硅胶柱层析分离、lh-20凝胶柱层析分离和制备型液相精细分离，追踪拮抗活性物质，得到化合物sj-1；或是，将sj81粗提物经第一次rp-c18硅胶柱层析分离、第一次lh-20凝胶柱层析分离、第二次rp-c18硅胶柱层析分离、第二次lh-20凝胶柱层析分离和正向硅胶柱层析分离，追踪拮抗活性物质，得到化合物sj-2。
5、根据本专利技术实施例的一种抗菌脂肽的制备方法，该方法对甲基营养型芽孢杆菌sj80或sj81进行发酵培养，乙酸乙酯萃取后，获得具有较好的抑菌效果，且有较低的细胞毒性的粗提物；以马铃薯疮痂链霉菌为指示菌，经反复lh-20分子筛、rp-c18硅胶柱和正相硅胶柱层析，对粗提物进行分离纯化，获得可以抑制马铃薯疮痂病的抗菌脂肽sj-1或sj-2，与市售农药相比，是有潜力的生防菌剂。
6、可选地，所述化合物sj-1的结构式如下：
7、
8、所述化合物sj-2的结构式如下：
9、
10、可选地，在发酵步骤中，置于37℃恒温振荡培养箱中，180rpm震荡培养3天。
11、可选地，sj80粗提物的分离纯化是：
12、第一次rp-c18硅胶柱层析分离、将sj80粗提物用少量甲醇溶解，装入提前冲洗好的rp-c18色谱柱中，以25％水–75％甲醇、50％水–50％甲醇、75％水–25％甲醇、100％甲醇配制成的流动相进行洗脱，共洗脱4个梯度，每梯度收集1.5l洗脱溶液，将收集到的24管流份经过旋转蒸发仪真空浓缩，用甲醇复溶，进行tlc显色，并用滤纸片法检验活性，将物质相似的活性组分合并，在100％甲醇梯度时得到活性组分x1；
13、第二次rp-c18硅胶柱层析分离、将x1组分用适量甲醇溶解，装入rp-c18色谱柱中，以20％水–80％甲醇、15％水–85％甲醇、10％水–90％甲醇、5％水–95％甲醇配制成的流动相进行洗脱，共洗脱4个梯度，每梯度收集600ml洗脱溶液，将收集到的24管流份减压浓缩用甲醇复溶后，进行tlc显色并用滤纸片法检验活性，将物质相似的组分合并，在15％水–85％甲醇、10％水–90％甲醇梯度时得到活性组分x2；
14、lh-20凝胶柱层析分离、将x2组分用适量甲醇溶解，装入甲醇润好的sephadex lh-20凝胶色谱柱，以100％甲醇、25s/d的流速进行洗脱，每30min收集一管，共收集49管流份，用tlc薄层层析法和生物自显影法进行分析，选择合并29–45管，记为组分x3；
15、制备型液相精细分离、利用安捷伦高效液相色谱仪对x3组分进行精细分离，选择流动相为22％水-78％乙腈等梯度洗脱，进样量500μl，流速2ml/min，在210nm下定峰收集，通过hplc共收集到3个主要的峰，对收集到的峰用滤纸片法逐一验证活性，确定活性组分为2号峰，定峰收集活性化合物sj-1。
16、可选地，sj81粗提物的分离纯化是：
17、第一次rp-c18硅胶柱层析分离、将sj81粗提物用少量甲醇溶解，装入提前冲洗好的rp-c18色谱柱中，以40％水–60％甲醇、30％水–70％甲醇、20％水–80％甲醇、10％水–90％甲醇、100％甲醇配制成的流动相进行洗脱，共洗脱5个梯度，每梯度收集1.25l洗脱溶液，经过旋转蒸发仪真空浓缩，将收集到的25管浓缩流份用甲醇复溶，进行tlc显色，并用滤纸片法检验活性，在10％水–90％甲醇梯度时得到抑菌活性组分y1；
18、第一次lh-20凝胶柱层析分离、将y1组分用适量甲醇溶解，装入甲醇润好的sephadex lh-20凝胶色谱柱，以100％甲醇、11s/d的流速进行洗脱，每30min收集一管，将收集到的130管流份，用tlc薄层层析法和滤纸片法进行分析合并有抑菌活性的88–101管，记为组分y2；
19、第二次rp-c18硅胶柱层析分离、将y2组分用适量甲醇溶解，装入rp-c18色谱柱进一步分离，以40％水–60％甲醇、30％水–70％甲醇、20％水–80％甲醇、10％水–90％甲醇、100％甲醇配制成的流动相进行洗脱，共洗脱5个梯度，每梯度收集500ml洗脱溶液，将收集到的50管流份用tlc薄层层析法和滤纸片法进行分析，将有抑菌活性的35-42管合并，记为组分y3；
20、第二次lh-20凝胶柱层析分离、将y3组分浓缩，用适量甲醇溶解，装入甲醇润好的sephadex lh-20凝胶色谱柱中，以100％甲醇、20s/d的流速进行洗脱，每30min收集一管，共收集130管流份，用tlc薄层层析法进行分析，合并条带明显的81–101管，记为组分y4；
21、正向硅胶柱层析分离、取y4组分用适量甲醇溶解，装入正向硅胶柱中，以石油醚∶乙酸乙酯＝4∶5的梯度洗脱96管，利用tlc法水显色追踪和生物自显影法验证流份抑菌活性，得到活性化合物sj-2。
22、本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
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1.一种抗菌脂肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述化合物SJ-1的结构式如下：
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在发酵步骤中，置于37℃恒温振荡培养箱中，180rpm震荡培养3天。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，SJ80粗提物的分离纯化是：
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，SJ81粗提物的分离纯化是：
【技术特征摘要】
1.一种抗菌脂肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述化合物sj-1的结构式如下：
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在发酵步骤中，置于3...
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