【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体而言，涉及一种检测内毒素的方法。
技术介绍
1、内毒素是由多糖、脂质和蛋白质组成的复合体，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一。当细菌破裂后，内毒素会释放出来，内毒素是一种毒性极强的致炎和热原物质，是内毒素血症及感染性休克的主要致病介质，其能够引起发热反应，如白细胞反应、内毒素血症、内毒素休克和弥散性血管内凝血等。因此，内毒素检测在环境监测、药厂质量控制、医疗器械热原监测等领域具有十分重要的意义。
2、目前，内毒素的检测方法包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质(比色)法，分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来定量测定内毒素。但是现有的内毒素检测方法容易受到干扰，导致内毒素的检测误差较大，并影响内毒素的检测效率。
技术实现思路
1、本专利技术旨在解决现有的内毒素检测容易受到干扰，导致内毒素检测误差较大，以及影响内毒素的检测效率的问题。
2、为解决上述问题，本专利技术提供一种检测内毒素的方法，包括如下步骤：
3、确定目标蛋白为hrg蛋白；
4、根据所述hrg蛋白，制备与所述hrg蛋白特异性结合的hrg单克隆抗体；
5、将所述hrg单克隆抗体与磁珠微球偶联，得到hrg单克隆抗体磁珠；
6、将带有内毒素的待测液i与所述hrg单克隆抗体磁珠混合，待目标蛋白充分结合
7、进一步地，每1ml所述带有内毒素的待测液i中加入0.1mg至1mg所述hrg单克隆抗体。
8、进一步地，所述将所述hrg单克隆抗体与磁珠微球偶联，得到hrg单克隆抗体磁珠，包括：
9、选取带有羧基的磁珠微球；
10、用活化剂对所述磁珠微球进行活化，得到第一磁珠；
11、将所述hrg单克隆抗体、所述第一磁珠和硼酸盐buffer混合，振荡反应后，得到混合液，将所述混合液离心分离后，得到第二磁珠；
12、用封闭剂对所述第二磁珠进行封闭，得到第三磁珠；
13、将所述第三磁珠进行清洗后，进行重悬，得到hrg单克隆抗体磁珠。
14、进一步地，所述hrg单克隆抗体和所述第一磁珠的质量比为1:1至10:1。
15、进一步地，根据所述磁珠微球的羧基含量加入活化剂，所述磁珠微球的羧基含量和所述活化剂的质量比为1:10至1:100，所述活化剂为edc和nhs，edc和nhs的摩尔比为1:1至10:1。
16、进一步地，所述制备hrg单克隆抗体，包括：
17、将hrg蛋白乳化后，进行小鼠注射免疫，免疫后经elisa检测小鼠尾部血清的效价；
18、选择经elisa法检测血清效价满足要求的小鼠，分离出其脾细胞，并与小鼠骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；
19、通过elisa法对所述杂交瘤细胞进行筛选，体外培养筛选出的杂交瘤细胞，分离纯化hrg单克隆抗体。
20、进一步地，所述将hrg抗原乳化后，进行小鼠注射免疫，免疫后经elisa法检测小鼠尾部血清的效价，包括：
21、以hrg蛋白作为抗原，对6周龄至8周龄小鼠进行第一次注射免疫，第一次注射免疫时将所述hrg蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，在小鼠的皮下进行注射；
22、间隔两周之后，进行第二次注射免疫，第二次注射免疫时将所述hrg蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，在小鼠的皮下进行注射；继续间隔两周后，进行第三次注射免疫，方法与第二次相同；
23、取免疫后的小鼠的静脉尾血，离心取血清，用elisa法检测免疫小鼠血清效价。
24、进一步地，所述选择经elisa法检测血清效价满足要求的小鼠，分离出其脾细胞，并与小鼠骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤，包括：
25、选择经elisa法检测血清效价满足要求的小鼠，分离出脾细胞，并将所述脾细胞重悬，制成脾细胞悬液；
26、融合前两周复苏sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，并置于培养基中进行培养，融合当天，收集小鼠骨髓瘤细胞，将所述小鼠骨髓瘤细胞重悬，制成骨髓瘤细胞悬液；
27、将所述脾细胞悬液和所述骨髓瘤细胞悬液混合均匀，进行融合，形成杂交瘤，其中，脾细胞和骨髓瘤细胞的数量比为5:1至10:1。
28、进一步地，所述通过elisa法对所述杂交瘤细胞进行筛选，体外培养筛选出的杂交瘤细胞，分离纯化hrg单克隆抗体，包括：
29、收集杂交瘤细胞的培养液，用elisa方法测定每个细胞培养孔的培养液的吸光度，筛选出吸光度高的杂交瘤细胞；
30、对筛选的杂交瘤细胞进行单克隆化，筛选出单克隆生长的阳性细胞株，用elisa方法测定每个阳性细胞株分泌的hrg单克隆抗体的浓度，筛选出hrg单克隆抗体浓度高的阳性细胞株；
31、对分泌hrg单克隆抗体浓度高的阳性细胞株进行单克隆化，直至阳性率达到100％，完成杂交瘤细胞的筛选；
32、将筛选出来的杂交瘤细胞进行体外培养，用proptein g亲和层析柱分离纯化hrg单克隆抗体。
33、进一步地，所述确定目标蛋白为hrg蛋白，包括：
34、在动物的血液中利用蛋白质之间的相互作用，通过pull down实验，富集与蛋白鲎c因子有相互作用的蛋白，通过质谱实验以及生物信息学分析，确定与蛋白鲎c因子有相互作用的蛋白为hrg蛋白。
35、本专利技术所述的检测内毒素的方法，通过先确定目标蛋白为hrg蛋白，再以hrg蛋白作为抗原对制备得到抗hrg蛋白的单克隆抗体，将hrg单克隆抗体偶联至磁珠微球上，通过偶联在磁珠微球上的hrg单克隆抗体捕获带有内毒素的待测液i中的目标蛋白，将目标蛋白吸附在磁珠微球上，分离磁珠微球之后，得到的带有内毒素的待测液ii中目标蛋白的含量大大降低，实现了对带有内毒素的待测液ii中的目标蛋白进行屏蔽的作用，排除了内毒素检测的干扰因素，提高了内毒素检测的准确性；此外，在对待测液进行内毒素检测之前对待测液进行预处理，能够提高检测结果的稳定性和可靠性，也能够大大缩短检测的时间，提高检测的效率，节省了人力和物力，有利于降低检测的成本。
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1.一种检测内毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测内毒素的方法，其特征在于，每1mL所述带有内毒素的待测液I中加入0.1mg至1mg所述HRG单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的检测内毒素的方法，其特征在于，所述将所述HRG单克隆抗体与磁珠微球偶联，得到HRG单克隆抗体磁珠，包括：
4.根据权利要求3所述的检测内毒素的方法，其特征在于，所述HRG单克隆抗体和所述第一磁珠的质量比为1:1至10:1。
5.根据权利要求3所述的检测内毒素的方法，其特征在于，根据所述磁珠微球的羧基含量加入活化剂，所述磁珠微球的羧基含量和所述活化剂的质量比为1:10至1:100，所述活化剂为EDC和NHS，EDC和NHS的摩尔比为1:1至10:1。
6.根据权利要求1所述的检测内毒素的方法，其特征在于，所述制备HRG单克隆抗体，包括：
7.根据权利要求6所述的检测内毒素的方法，其特征在于，所述将HRG抗原乳化后，进行小鼠注射免疫，免疫后经ELISA法检测小鼠尾部血清的效价，包括：
8.根据
9.根据权利要求6所述的检测内毒素的方法，其特征在于，所述通过ELISA法对所述杂交瘤细胞进行筛选，体外培养筛选出的杂交瘤细胞，分离纯化HRG单克隆抗体，包括：
10.根据权利要求1所述的检测内毒素的方法，其特征在于，所述确定目标蛋白为HRG蛋白，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种检测内毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测内毒素的方法，其特征在于，每1ml所述带有内毒素的待测液i中加入0.1mg至1mg所述hrg单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的检测内毒素的方法，其特征在于，所述将所述hrg单克隆抗体与磁珠微球偶联，得到hrg单克隆抗体磁珠，包括：
4.根据权利要求3所述的检测内毒素的方法，其特征在于，所述hrg单克隆抗体和所述第一磁珠的质量比为1:1至10:1。
5.根据权利要求3所述的检测内毒素的方法，其特征在于，根据所述磁珠微球的羧基含量加入活化剂，所述磁珠微球的羧基含量和所述活化剂的质量比为1:10至1:100，所述活化剂为edc和nhs，edc和nhs的摩尔比为1:1至10:1。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：董凡，刘虎，金宗文，胡佩文，陈鹏，
申请(专利权)人：健帆生物科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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