本发明专利技术公开了一种吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原及其应用。本发明专利技术制备的半抗原避免了结构类似物的共同骨架，充分暴露了吡唑醚菌酯独有的特征结构，制备了高特异性、高灵敏度的吡唑醚菌酯抗体，同时简化了吡唑醚菌酯半抗原的合成步骤，提供了两种全新的吡唑醚菌酯半抗原，并建立了检测吡唑醚菌酯的间接竞争ELISA检测方法，最低检测限LOD为0.23ng/mL，定量检测范围为0.57～12.57ng/mL，对吡唑醚菌酯的类似物均无交叉反应，可推广用于吡唑醚菌酯大规模快速精准筛查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品检测，具体地，涉及一种吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原及其应用。
技术介绍
1、吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)又称百克敏/唑菌胺酯，白色至浅米色无味结晶体，难溶于水，溶于乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂。吡唑醚菌酯为新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过抑制线粒体呼吸作用，最终导致细胞死亡，具有保护、治疗、叶片渗透传导作用，主要用于防冶作物上由真菌引起的多种病害，对葡萄白粉病、枇杷角斑病、柑橘疮痂病、小麦白粉病等都具有较好的防治功效。
2、目前吡唑醚菌酯的检测主要集中在香蕉、柑橘、葡萄、黄瓜等样品中。分析方法主要有气相色谱法(gc)、气象色谱-质谱联用法(gc-ms)、高效液相色谱法(hplc)等。现有技术cn111961002a和cn112114147a公开了用于吡唑醚菌酯检测的半抗原、抗原、抗体等，但由于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂存在共同骨架(如图1所示，标红部分为共同骨架)，而上述专利的半抗原设计包含此共同骨架，造成抗体对该类结构类似物的非特异性识别。除此之外，上述专利亦存在合成步骤较多的问题。
3、因此，在建立免疫学检测方法并应用该检测方法快速检测果蔬中吡唑醚菌酯含量时，关键技术在于能够获得特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件是合成、制备出合适的吡唑醚菌酯半抗原。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中缺少快速、灵敏且简便的吡唑醚菌酯免疫检测方法的问题，本专利技术提供了一种吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原及其应用。
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p>2、本专利技术的第一个目的是提供2种吡唑醚菌酯半抗原。3、本专利技术的第二个目的是提供所述吡唑醚菌酯半抗原的制备方法。
4、本专利技术的第三个目的是提供2种吡唑醚菌酯人工抗原。
5、本专利技术的第四个目的是提供所述吡唑醚菌酯人工抗原在制备吡唑醚菌酯的抗体中的应用。
6、本专利技术的第五个目的是提供一种吡唑醚菌酯人工抗原组合。
7、本专利技术的第六个目的是提供所述吡唑醚菌酯人工抗原组合在制备检测吡唑醚菌酯的试剂盒中的应用。
8、本专利技术的第七个目的是提供一种检测吡唑醚菌酯的试剂盒。
9、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
10、免疫分析方法的关键在于设计出合适的半抗原，从而制备出灵敏度高、特异性强的抗体。在进行半抗原设计时尽量避免保留这些结构类似物共同骨架，而应该要暴露目标分析物独有的特征结构，是提高抗体特异性识别的更好策略。本专利技术采用一步法策略引入线型间隔臂，在充分暴露吡唑醚菌酯特征结构的同时，避免了结构类似物的共同骨架，制备了高灵敏度、高特异性的吡唑醚菌酯半抗原，同时提供了更为简易、实用的吡唑醚菌酯半抗原合成思路。
11、一种吡唑醚菌酯半抗原，即吡唑醚菌酯半抗原pye，其结构式如式(i)所示，
12、
13、吡唑醚菌酯半抗原pye采用系统命名法命名为：4-((2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯基)氨基)丁酸，即4-((2-(((1-(4-chlorophenyl)-1h-pyrazol-3-yl)oxy)methyl)phenyl)amino)butanoic acid。
14、另一种吡唑醚菌酯半抗原，即吡唑醚菌酯半抗原pyg，其结构式如式(ii)所示，
15、
16、吡唑醚菌酯半抗原pye采用系统命名法命名为：(2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯基)氨基乙酸，即(2-(((1-(4-chlorophenyl)-1h-pyrazol-3-yl)oxy)methyl)phenyl)glycine。
17、任一所述吡唑醚菌酯半抗原在制备吡唑醚菌酯人工抗原中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。
18、结构式如式(i)所示化合物，即吡唑醚菌酯半抗原pye的制备方法，包括以下步骤：
19、2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯胺、4-溴丁酸乙酯、碳酸钾和碘化钠与乙腈充分反应，所得反应物在碱性环境下充分水解，之后调节ph至酸性，即得；
20、
21、优选地，所述2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯胺、4-溴丁酸乙酯、碳酸钾和碘化钠的摩尔比为1::(1～2):(0.5～1):(0.1～1)。
22、更优选地，所述2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯胺、4-溴丁酸乙酯、碳酸钾和碘化钠的摩尔比为1:1.5:0.5:0.1。
23、优选地，2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯胺、4-溴丁酸乙酯、碳酸钾和碘化钠与乙腈充分反应；分离纯化反应物，并将分离纯化的反应物在碱性环境下充分水解，通过柱层析法分离纯化后，调节ph为1～2，干燥即得。
24、优选地，所述碱性环境包括氢氧化锂和甲醇。
25、更优选地，所述碱性环境由氢氧化锂、甲醇和水组成。
26、具体的，吡唑醚菌酯半抗原pye的制备方法，包括以下步骤：
27、将2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯胺(cas号：222838-33-7)(0.67mmol)：4-溴丁酸乙酯(1.005mmol)溶于乙腈，加入碳酸钾(0.33mmol)、碘化钠(0.067mmol)，在50℃、氮气保护下反应过夜(12h)；分离纯化反应物，并将分离纯化的反应物与5ml 1mol/l氢氧化锂溶液(lioh-h2o)和10ml50％v/v甲醇水溶液在室温(27℃)下搅拌3～5h充分水解，通过柱层析法(固定相为硅胶，流动相为石油醚：乙酸乙酯的体积比＝10：1)分离纯化后，然后调节ph为1～2，干燥即得半抗原pye。
28、结构式如式(ⅱ)所示化合物，即吡唑醚菌酯半抗原pyg的制备方法，包括以下步骤：
29、2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯胺、溴乙酸乙酯、碳酸钾和碘化钠与乙腈充分反应，所得反应物在碱性环境下充分水解，之后调节ph至酸性，即得；
30、
31、优选地，所述2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯胺、、溴乙酸乙酯、碳酸钾和碘化钠的摩尔比为1:(1～2):(0.5～1):(0.1～1)。
32、更优选地，所述2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯胺、溴乙酸乙酯、碳酸钾和碘化钠的摩尔比为1::1.5:0.5:0.1。
33、优选地，2-(((1-(4-氯苯基)-1h-吡唑-3-基)氧基)甲基)苯胺、溴乙酸乙酯、碳酸钾和碘化钠与乙腈充分反应；分离纯化反应物，并将分离纯化的反应物在碱性环境下充分水解，通过柱层析法分离纯化后，然后调节ph为1～2，干燥即得。
34、优选地，所述碱性环境包括氢氧化锂本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种吡唑醚菌酯半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示，
2.一种吡唑醚菌酯半抗原，其特征在于，其结构式如式(II)所示，
3.结构式如式(I)所示化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.结构式如式(Ⅱ)所示化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种吡唑醚菌酯人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述吡唑醚菌酯半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(Ⅲ)所示，
6.一种吡唑醚菌酯人工抗原，其特征在于，由权利要求2所述吡唑醚菌酯半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如(Ⅳ)所示，
7.权利要求5和/或权利要求6所述吡唑醚菌酯人工抗原在制备吡唑醚菌酯的抗体中的应用。
8.一种吡唑醚菌酯人工抗原组合，其特征在于，包含免疫原和包被原，所述免疫原为权利要求5所述吡唑醚菌酯人工抗原；所述包被原为权利要求5或权利要求6所述吡唑醚菌酯人工抗原。
9.权利要求8所述吡唑醚菌酯人工抗原组合在制备检测吡唑醚菌酯的试剂盒中的应用。
10.一种检测吡唑醚菌酯的试剂盒，其特征在于，包含权利要求8所述吡唑醚菌酯人工抗原组合。
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【技术特征摘要】
1.一种吡唑醚菌酯半抗原，其特征在于，其结构式如式(i)所示，
2.一种吡唑醚菌酯半抗原，其特征在于，其结构式如式(ii)所示，
3.结构式如式(i)所示化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.结构式如式(ⅱ)所示化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种吡唑醚菌酯人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述吡唑醚菌酯半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(ⅲ)所示，
6.一种吡唑醚菌酯人工抗原，其特征在于，由权利要求2所述吡唑醚菌酯半抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：雷红涛，陈培煊，刘志威，潘康亮，关甜，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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