【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、由功能异常基因引起的遗传疾病占全球疾病的很大一部分。基因疗法正成为一种有前景的治疗形式，旨在减轻遗传疾病的影响。
技术实现思路
1、在本公开之前，某些利用同源重组的aav基因疗法(例如，generidetm)采用包含相同长度的同源臂的病毒载体组合物。本公开尤其认识到，特定长度(例如，各自至少750nt或至少1000nt)的同源臂可展示改进的编辑活性。在一些实施方案中，本公开认识到，当同源臂具有不同长度时，特定长度(例如，各自至少750nt或至少1000nt)的同源臂可展示编辑活性的额外改进。
2、或者或另外，本公开进一步涵盖认识到载体设计中先前未识别的问题。部分地，本公开涵盖认识和观测到优化的载体设计，包括特定同源臂长度和/或各同源臂的长度之间的比率，在物种之间可能不同。如本文所证明，一个物种或一个物种的模型系统(例如，野生型小鼠、人源化小鼠、嵌合小鼠)中的最佳设计可能不同于另一个物种或另一个物种的模型系统(例如，野生型小鼠、人源化小鼠、嵌合小鼠)中的那些最佳设计。
3、本公开尤其提供用于改进病毒载体(包括aav载体)的设计和/或生产的方法和技术。根据各种实施方案，本公开提供病毒载体构建体的某些序列元件(例如，同源臂序列)可能显著影响基因编辑效率的见解。在一些实施方案中，本公开证明，在特定时间点(例如，出生后时间点)施用本文所述的一种或多种病毒载体组合物(例如，包含平衡或不平衡同源臂)可提高编辑效率。在一些实施方案中，基于靶细胞或组织生长阶段
4、在一些实施方案中，本公开提供重组病毒载体，所述重组病毒载体包括编码以下的多核苷酸序列中的至少一者：1)第一核酸序列和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列包含至少一个外源基因序列并且所述第二核酸序列位于所述第一核酸序列的5'或3'并且在整合至目标整合位点中之后促进两个独立基因产物的产生；2)第三核酸序列，所述第三核酸序列位于多核苷酸的5'并且包含与所述目标整合位点的基因组序列5'同源的序列；和3)第四核酸序列，所述第四核酸序列位于所述多核苷酸的3'并且包含与所述目标整合位点的基因组序列3'同源的序列，其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列中的每一者的长度为至少1000nt并且其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列的长度不同。在一些实施方案中，所提供的病毒载体还包括长度在500nt与2500nt之间的外源基因序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度在1000nt与2000nt之间的外源基因序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度为至少750nt的第三核酸序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度为至少1000nt的第三核酸序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度为至少1600nt的第三核酸序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度为至少750nt的第四核酸序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度为至少1000nt的第四核酸序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度为至少1600nt的第四核酸序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度均为至少750nt的第三核酸序列和第四核酸序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度均为至少1000nt的第三核酸序列和第四核酸序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度为1000nt的第三核酸序列和长度为1600nt的第四核酸序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体包括长度为1600nt的第三核酸序列和长度为1000nt的第四核酸序列。在一些实施方案中，所提供的病毒载体为aav载体。在一些实施方案中，所提供的病毒载体为选自aav2、aav8、aav9、aav-dj、aav-lk03或aav-sl65的aav载体。
5、在一些实施方案中，所提供的组合物包括一种或多种药学上可接受的赋形剂和重组病毒载体，所述重组病毒载体包含编码以下的多核苷酸序列中的至少一者：1)第一核酸序列和第二核酸序列，其中所述第一核酸序列包含至少一个外源基因序列并且所述第二核酸序列位于所述第一核酸序列的5'或3'并且在整合至目标整合位点中之后促进两个独立基因产物的产生；2)第三核酸序列，所述第三核酸序列位于多核苷酸的5'并且包含与所述目标整合位点的基因组序列5'同源的序列；和3)第四核酸序列，所述第四核酸序列位于所述多核苷酸的3'并且包含与所述目标整合位点的基因组序列3'同源的序列，其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列中的每一者的长度为至少1000nt并且其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列的长度不同。
6、在一些实施方案中，所提供的组合物用于将转基因整合至受试者组织中的一个或多个细胞的基因组中的方法中，其中向所述组织中的细胞不能表达由基因产物编码的功能性蛋白质的受试者施用所述组合物并且目标整合位点在所述一个或多个细胞的基因组中。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中施用，其中一个或多个细胞为非分裂细胞。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中施用，其中一个或多个细胞为肝、肌肉、肺或cns细胞。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中在出生后时段内施用。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中在出生后至少7天、出生后至少14天、出生后至少21天或出生后至少28天施用。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中在出生后28天或之前施用。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中施用，其中转基因为或包含ugt1a1、fah、因子ix、a1at、asl或lipa。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中施用，其中整合效率相对于参考组合物提高。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中以至少5e13vg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中以至少1e14vg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中以至少2e14 vg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中施用，其中受试者为动物。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中施用，其中受试者为人类。在一些实施方案中，所提供的组合物可在方法中施用，其中受试者患有或疑似患有克里格勒-纳贾尔综合征(crigler-najjar syndrome)、酪氨酸血症、血友病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、精氨酰丁二酸尿症或溶酶体酸性脂肪酶缺乏症。
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1.一种用于将转基因整合至细胞基因组中的目标整合位点中的重组病毒载体，所述重组病毒载体包含：
2.如权利要求1所述的重组病毒载体，其中所述外源基因序列的长度在500nt与2500nt之间。
3.如权利要求1或2所述的重组病毒载体，其中所述基因序列的长度在1000nt与2000nt之间。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列的长度为至少750nt。
5.如权利要求4所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列的长度为至少1000nt。
6.如权利要求5所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列的长度为至少1600nt。
7.如权利要求1-3中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第四核酸序列的长度为至少750nt。
8.如权利要求7所述的重组病毒载体，其中所述第四核酸序列的长度为至少1000nt。
9.如权利要求8所述的重组病毒载体，其中所述第四核酸序列的长度为至少1600nt。
10.如权利要求1-4或7中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列
11.如权利要求1-5或7-8中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列两者的长度均为至少1000nt。
12.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列的长度为1000nt并且所述第四核酸序列的长度为1600nt。
13.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列的长度为1600nt并且所述第四核酸序列的长度为1000nt。
14.如权利要求1-13中任一项所述的重组病毒载体，其中所述病毒载体为AAV载体。
15.如权利要求14所述的重组病毒载体，其中所述病毒载体选自AAV2、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV-LK03或AAV-sL65。
16.一种组合物，所述组合物包含：
17.一种将转基因整合至受试者组织中的一个或多个细胞的基因组中的方法，所述方法包括向所述组织中的细胞不能表达由基因产物编码的功能性蛋白质的受试者施用如权利要求16所述的组合物，其中所述目标整合位点在所述一个或多个细胞的所述基因组中。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述一个或多个细胞为非分裂细胞。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述一个或多个细胞为肝细胞、肌肉细胞、肺细胞或CNS细胞。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中在出生后时段内施用所述组合物。
21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中在出生后至少7天、出生后至少14天、出生后至少21天或出生后至少28天施用所述组合物。
22.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中在出生后28天或之前施用所述组合物。
23.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中所述转基因为或包含UGT1A1、FAH、因子IX、A1AT、ASL或LIPA。
24.如权利要求17-23中任一项所述的方法，其中相对于参考组合物，整合效率得到改进。
25.如权利要求17-24中任一项所述的方法，其中以至少5E13vg/kg的剂量施用所述组合物。
26.如权利要求17-25中任一项所述的方法，其中以1E14 vg/kg的剂量施用所述组合物。
27.如权利要求17-26中任一项所述的方法，其中以2E14 vg/kg的剂量施用所述组合物。
28.如权利要求17-27中任一项所述的方法，其中所述受试者为动物。
29.如权利要求17-28中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述受试者患有或疑似患有克里格勒-纳贾尔综合征、酪氨酸血症、血友病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、精氨酰丁二酸尿症或溶酶体酸性脂肪酶缺乏症。
31.一种确定包含至少一个有效负载、5'同源臂和3'同源臂的多核苷酸盒的同源臂长度的方法，所述方法包括
32.一种用于将转基因整合至细胞基因组中的目标整合位点中的重组病毒载体，所述重组病毒载体包含：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于将转基因整合至细胞基因组中的目标整合位点中的重组病毒载体，所述重组病毒载体包含：
2.如权利要求1所述的重组病毒载体，其中所述外源基因序列的长度在500nt与2500nt之间。
3.如权利要求1或2所述的重组病毒载体，其中所述基因序列的长度在1000nt与2000nt之间。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列的长度为至少750nt。
5.如权利要求4所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列的长度为至少1000nt。
6.如权利要求5所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列的长度为至少1600nt。
7.如权利要求1-3中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第四核酸序列的长度为至少750nt。
8.如权利要求7所述的重组病毒载体，其中所述第四核酸序列的长度为至少1000nt。
9.如权利要求8所述的重组病毒载体，其中所述第四核酸序列的长度为至少1600nt。
10.如权利要求1-4或7中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列两者的长度均为至少750nt。
11.如权利要求1-5或7-8中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列和所述第四核酸序列两者的长度均为至少1000nt。
12.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列的长度为1000nt并且所述第四核酸序列的长度为1600nt。
13.如前述权利要求中任一项所述的重组病毒载体，其中所述第三核酸序列的长度为1600nt并且所述第四核酸序列的长度为1000nt。
14.如权利要求1-13中任一项所述的重组病毒载体，其中所述病毒载体为aav载体。
15.如权利要求14所述的重组病毒载体，其中所述病毒载体选自aav2、aav8、aav9、aav-dj、aav-lk03或aav-sl65。
16.一种组合物，所述组合物包含：
17.一种将转基因整合至受试者组织中的一个或多个细胞的基因组中的方法...
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