【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和动物传染病领域，具体涉及一种副猪格拉瑟菌基因表达盒及预防格拉瑟病的弱毒疫苗株。
技术介绍
1、副猪格拉瑟菌是猪上呼吸道的病原菌，可引起以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的格拉瑟病。该病当前存在于世界上所有养猪的国家和地区。副猪格拉瑟菌有15个血清型和近30％不可分型的菌株，而且格拉瑟病也与其他传染病同时发生。因此，预防格拉瑟病的商业化疫苗为多价或多联苗，以灭活的菌苗和亚单位苗为主。然而，灭活疫苗主要诱导血清型特异的抗体，亚单位疫苗能提供的抗原种类有限。如果可以使用弱毒疫苗，则不仅能诱导包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫在内的多种免疫反应，而且可以使机体产生不同血清型和菌株间的交叉免疫保护。因此，构建并应用安全有效的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株，对提高格拉瑟病的免疫防控具有重要意义。
2、目前，国内外尚无猪格拉瑟病的弱毒活疫苗，主要有以下两个原因：
3、1.副猪格拉瑟菌具有很强的限制修饰系统，导致其遗传操作较为困难；
4、2.副猪格拉瑟菌的致病和免疫机制尚未阐明，难于进行疫苗的分子设计。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种副猪格拉瑟菌基因表达盒及预防格拉瑟病的弱毒疫苗株；本专利技术将启动子pygiw和apd基因拼接得到表达盒pygiw-apd，以副猪格拉瑟菌cf7066为亲本株，使用flp-frt无抗缺失突变系统，将表达盒pygiw-apd整合到基因组中唾液酸酶nanh的基因座，构建了弱毒疫苗株cf7066
2、为实现上述目的，本专利技术所设计的技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种副猪格拉瑟菌基因表达盒，所述表达盒由启动子pygiw和apd基因拼接而成，且表达盒pygiw-apd的核苷酸序列如seq id no.3所示。
4、上述副猪格拉瑟菌基因表达盒pygiw-apd的构建方法，包括以下步骤：
5、(1)用引物对p1/2从副猪格拉瑟菌cf7066株基因组扩增ygiw基因的启动子pygiw片段(168bp)，其核苷酸序列如seq id no.1所示；其中，引物对p1/2如下：
6、引物p1：5’-ttttttcataatgtgatctaagcgg-3’，
7、引物p2：5’-aaatgcataaattgctcctagtgtttattagtaaaagc-3’；
8、(2)用引物对p3/4扩增apd基因的开放读码框orf(2580bp)，其核苷酸序列如seq idno.2所示；其中，引物对p5/6如下：
9、引物p3：5’-atgcatttccgaaaatcccctttagcg-3’，
10、引物p4：5’-ttaaaatttccaatctaaccctaaag-3’；
11、(3)将步骤(1)和(2)中获得的两个dna片段无缝克隆拼接，得到apd基因的表达盒pygiw-apd(2748bp)，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
12、本专利技术还提供了一种上述副猪格拉瑟菌基因表达盒在构建预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株中的应用。
13、本专利技术还提供了一种预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株cf7066δnanh::pygiw-apd，所述预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株cf7066δnanh::pygiw-apd以副猪格拉瑟菌cf7066株为亲本株cf7066；在缺失唾液酸酶基因nanh的同时，并在其基因座插入权利要求1所述的副猪格拉瑟菌基因表达盒pygiw-apd；其中，所述唾液酸酶基因缺失区域的核苷酸序列如seq id no.4所示。
14、本专利技术还提供了一种上述预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株cf7066δnanh::pygiw-apd的构建方法，包括以下步骤：
15、(1)质粒pkfy的构建
16、a.从副猪格拉瑟菌cf7066株的基因组dna，用引物对p9/10和p11/12分别扩增缺失区域的一侧同源臂片段nanh-down(其序列如seq id no.5所示)和另一侧同源臂片段nanh-up(其序列如seq id no.6所示)，并在上下游同源臂的外侧均添加uss序列(下划线区)；即得到nanh-down-uss和nanh-up-uss；其中，引物对p9/10和p11/12如下：
17、引物p9：5’-gaggatccacaagcggtttatatgctttttgctcgccg-3’，
18、引物p10：5’-ccttgaatggaatcttcctg-3’，
19、引物p11：5’-accaagtatttcctccatcttctgaa-3’，
20、引物p12：5’-ttcaccgcttgtcatcgtacgtcgtcgtggc-3’；
21、b.用引物p13/14从质粒pkf-δnanh中扩增两端有frt位点的卡y那抗性表达盒(1593bp，seq id no.7所示)，其中引物对p13/14如下：
22、引物p13：5’-gattgtgtaggctggagctgct-3’，
23、引物p14：5’-atatgaatatcctccttagttcctattcc-3’；
24、c.用引物对p15/16，从质粒pkf-δnanh中扩增质粒复制原点puc ori(seq id no.8所示)，最后将上述nanh-down-uss、nanh-up-uss、卡那抗性表达盒和puc ori和apd基因表达盒pygiw-apd通过无缝克隆拼接，得到自杀性转移质粒pkfy；其中，所述引物对p15/16如下：
25、引物p15：5’-aaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgc-3’，
26、引物p16：5’-gcgttgctggcgtttttccataggctccgccc-3’；
27、(2)电转化flp酶表达质粒pgf到cf7066中，获得转化菌株cf7066(pgf)；
28、(3)自然转化转移质粒pkfy到步骤(2)获得的cf7066(pgf)株中，得到含有抗性的疫苗株cf7066δnanh::pygiw-apd-kanr。
29、(4)将步骤(3)获得的含有抗性的疫苗株cf7066δnanh::pygiw-apd-kanr在含有10mm阿拉伯糖的培养基tsa/gmr诱导，表达的flp本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种副猪格拉瑟菌基因表达盒，其特征在于：所述表达盒由启动子PygiW和apd基因拼接而成，且表达盒PygiW-apd的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种权利要求1所述副猪格拉瑟菌基因表达盒PygiW-apd的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.一种权利要求1所述副猪格拉瑟菌基因表达盒在构建预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株中的应用。
4.一种预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株CF7066ΔnanH::PygiW-apd，其特征在于：所述预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株CF7066ΔnanH::PygiW-apd以副猪格拉瑟菌CF7066株为亲本株CF7066；在缺失唾液酸酶基因nanH的同时，并在其基因座插入权利要求1所述的副猪格拉瑟菌基因表达盒PygiW-apd；其中，所述唾液酸酶基因缺失区域的核苷酸序列如SEQ ID No.4。
5.一种权利要求4所述预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株CF7066ΔnanH::PygiW-apd的构建方法，包括以下步骤：
6.一种权利要求5所述副猪
...【技术特征摘要】
1.一种副猪格拉瑟菌基因表达盒，其特征在于：所述表达盒由启动子pygiw和apd基因拼接而成，且表达盒pygiw-apd的核苷酸序列如seq id no.3所示。
2.一种权利要求1所述副猪格拉瑟菌基因表达盒pygiw-apd的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.一种权利要求1所述副猪格拉瑟菌基因表达盒在构建预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株中的应用。
4.一种预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株cf7066δnanh::pygiw-apd，其特征在于：所述预防格拉瑟病的副猪格拉瑟菌弱毒疫苗株cf7...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓娟，肖静，王翘楚，李阳蕾，肖坤雪，宋玉平，蔡旭旺，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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