本专利提供了一种基于DNA纳米机器的地高辛超灵敏检测方法，构建的检测体系包括链置换的DNA纳米机器和以纳米金颗粒(AuNPs)为载体的邻位连接传感器；所述DNA纳米机器包括检测探针、信号探针和燃烧链；所述邻位连接体系包括AuNPs和与其偶连的一对邻近探针。本发明专利技术的特征在于当地高辛存在时，地高辛会特异性地与检测探针结合，引发检测探针发夹结构打开，触发整个DNA纳米机器的循环往复，释放出大量信号链，继而被连接在AuNPs上的邻近探针对识别，启动qPCR扩增，产生可检测的荧光信号，实现了对地高辛药物浓度的检测。本发明专利技术与传统方法相比，显著提高了其检测的灵敏度、特异性和准确度，具有较好的抗干扰能力，有望被广泛应用于监测安全范围极窄的地高辛血药浓度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学相关，具体涉及一种基于dna纳米机器的地高辛超灵敏检测方法。
技术介绍
1、地高辛是一种从洋地黄中提取出来的中效强心苷类药物，临床上主要用于控制充血性心力衰竭和房颤，是常用的经典药物之一。在治疗时，对心脏的作用表现为正性肌力作用，减慢心率，抑制心脏传导。但是此药物安全范围窄，个体差异大，治疗量与中毒量接近，合并用药不当可诱发或加重洋地黄中毒，故对地高辛的血药浓度监测具有重要的临床意义。
2、目前地高辛血药浓度的常用检测方法主要包括放射免疫(ria)、酶联免疫吸附分析法(elisa)、荧光免疫分析法(fia)、化学发光免疫分析法(clia)和液相-质谱联用分析法(lc-ms)等。其中，elisa法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，多用于定性检测；ria法所需时间较长，检测结果不稳定，重复性比elisa差，且存在放射性污染危险。fia法特异性强，敏感性高，但需要昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员，一般多在特定医疗机构使用。clia法反应快，试剂稳定性高，但是仪器设备及配套试剂多依赖进口，检测费用昂贵，应用受限。lc-ms费时且不易自动化。
技术实现思路
1、本专利技术针对上述技术问题，提供一种基于dna纳米机器的地高辛超灵敏检测方法，定量检测地高辛，灵敏度高、重复性好、成本低，可为临床医师、药师调整患者用药剂量从而获得最佳治疗效果提供依据，该技术具有较大的市场应用前景。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：
>3、一种基于dna纳米机器的地高辛超灵敏检测方法，其特征在于：包括检测探针、连接链、信号链、辅助链、燃料链、纳米金颗粒、探针dna1、探针dna2、tecp、10×t4buffer、t4dna连接酶、核糖核酸酶抑制剂、引物序列、qpcr检测试剂盒以及pbs缓冲液。4、上述检测探针、连接链、信号链、辅助链、燃料链、dna1和dna2以及引物序列如下：
5、检测探针：
6、5’-gtgaaaaaaccgctgtgatgttgatgtattagcgagggcggtgtccaacagcggttttttcacgaggaggttggcggtgg-3’
7、连接链：5’-tcaacatcacagcggttttttcactaggggcaatcagctaactacactgcct-3’
8、信号链：5’-aggcagtgtagttagctgattgc-3’
9、辅助链：5’-ccctagtgaaaaaaccgctgt-3’
10、燃料链：5’-aggcagtgtagttagctgattgcccctagtgaaaaaaccgctgt-3’
11、dna1:
12、5’-ttttttttttttttttttttttttttttttgcagccaggcagtgtagttagcgcaatcagc-3’
13、dna2:
14、5’-taactacactgcctacctcggaccctgcactttttttttttttttttttttttttttttt-3’
15、正向引物：5’-gcagccaggcagtgtagttagc-3’
16、反向引物：5’-gtgcagggtccgaggt-3’
17、上述连接链、信号链和辅助链组成三链复合结构——信号探针，所述检测探针由地高辛适配体序列和触发序列两部分组成，触发序列隐藏在检测探针的发夹结构中；当检测探针与地高辛结合时，暴露了触发序列，其随后与信号探针的toehold1区域的结合，通过toehold介导的链置换，释放出辅助链，暴露了信号探针的toehold2；当引入燃料链时，从toehold2处开始反应，燃料链和连接链完全杂交，使信号链从三链复合结构中释放出来。
18、上述的检测地高辛的方法包括以下步骤：
19、(1)将连接链、信号链和辅助探针加入pbs缓冲液中相混合，95℃孵育5min得三链复合结构-信号探针；
20、(2)将检测探针在95℃孵育5min，以得到茎环结构；再与步骤(1)中的信号探针混合；
21、(3)将燃料链和地高辛待测液加入步骤(2)所得溶液，37℃孵育2h；
22、(4)取步骤(3)中反应产物与10×t4buffer、1ut4dna连接酶、1nmaunps-dna溶液和2u核糖核酸酶抑制剂混合，总体积为10μl；在65℃下孵育5min，25℃下孵育10min，便于目标mirna与dna探针杂交；
23、(5)将t4dna连接酶加入步骤(4)所得溶液，在37℃下孵育2h，完成连接反应；
24、(6)采用sybrgreeni作为荧光染料，用2.5μl步骤(5)中连接产物进行后续的qpcr反应，可以通过监测系统中的ct值变化来确定地高辛的存在和浓度。
25、上述步骤(1)中的连接链、信号探针和辅助探针浓度均为10μmol/l，体积相同。
26、上述步骤(2)中的检测探针与步骤(3)中的燃料链浓度均为10μmol/l，体积相同。
27、本专利技术的有益效果是可以精确快速地确定溶液中的地高辛含量。与市场上现有的检测方法相比，本专利技术具有方便快速，成本较低，灵敏度高且特异性强等优点，有利于临床的推广使用。
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【技术保护点】
1.一种基于DNA纳米机器的地高辛超灵敏检测方法，其特征在于：包括检测探针、连接链、信号链、辅助链、燃料链、纳米金颗粒、探针DNA1、探针DNA2、TECP、10×T4 buffer、T4DNA连接酶、核糖核酸酶抑制剂、引物序列、qPCR检测试剂盒以及PBS缓冲液。
2.按权利要求1所述的检测地高辛的方法，其特征在于：其中检测探针、连接链、信号链、辅助链、燃料链、DNA1和DNA2以及引物序列分别为：
3.按权利要求1所述的检测地高辛的方法，其特征在于：所述连接链、信号链和辅助链组成三链复合结构-信号探针，所述检测探针由地高辛适配体序列和触发序列两部分组成，触发序列隐藏在检测探针的发夹结构中；当检测探针与地高辛结合时，暴露了触发序列，其随后与信号探针的toehold1区域的结合，通过toehold介导的链置换，释放出辅助链，继而暴露了信号探针的toehold2；当引入燃料链时，从toehold 2处开始反应，燃料链和连接链完全杂交，使信号链从三链复合结构中释放出来。
4.按权利要求1-3所述的检测地高辛的方法，其特征在于包括以下步骤：
<p>5.按权利要求4所述的检测地高辛的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的连接链、信号链和辅助链浓度均为10μmol/L，体积相同。6.按权利要求4所述的检测地高辛的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的检测探针与步骤(3)中的燃料链浓度均为10μmol/L，体积相同。
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【技术特征摘要】
1.一种基于dna纳米机器的地高辛超灵敏检测方法，其特征在于：包括检测探针、连接链、信号链、辅助链、燃料链、纳米金颗粒、探针dna1、探针dna2、tecp、10×t4 buffer、t4dna连接酶、核糖核酸酶抑制剂、引物序列、qpcr检测试剂盒以及pbs缓冲液。
2.按权利要求1所述的检测地高辛的方法，其特征在于：其中检测探针、连接链、信号链、辅助链、燃料链、dna1和dna2以及引物序列分别为：
3.按权利要求1所述的检测地高辛的方法，其特征在于：所述连接链、信号链和辅助链组成三链复合结构-信号探针，所述检测探针由地高辛适配体序列和触发序列两部分组成，触发序列隐藏在检测探针的发夹结构中；当检测探针与地...
【专利技术属性】
技术研发人员：左国伟，李珂宇，肖鹏，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：
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