【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质工程领域，特别是逆转录酶变体的开发。逆转录酶变体表现出一种或多种改进的感兴趣的特性。
技术介绍
1、cdna合成反应的主要挑战之一是cdna合成中来自rna二级结构的干扰。虽然较高的反应温度可以从模板rna中去除二级结构，但是在不使用有效的热稳定逆转录酶(rt)的情况下，升高的温度通常会导致较低的rt酶活性。野生型(wt)莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)逆转录酶是一种通常在较高温度下失活的rt酶。抑制剂也可以降低rt酶活性，诸如细胞裂解液、相关试剂和固定试剂中可能存在的抑制剂。低容量反应也可能对野生型(wt)mmlv逆转录酶活性有负面影响。mmlv的特定残基与热稳定性有关。已证实m39v、m66l、e69k、e302r、t306k、w313f、l/k435g和n454k位点可提高热稳定性，参见arezi等人(2009)nucleic acidsres.37(2):473-481、美国专利号7078208以及baranauskas等人,2012 prot engineering25(10):657-668，这些文献据此全文以引用方式并入。
2、细胞加工和分析方法和系统中使用的各种不同应用在本领域中是已知的，包括但不限于特定单独细胞的分析、不同细胞类型群体内不同细胞类型的分析、空间转录组学组织分析、用于环境、人类健康、流行病学和法医学应用的大群细胞的分析和表征。这些方法中的许多方法涉及模板转换寡核苷酸的使用，并且需要模板转换活性。
技术实现思路
1、提供了
2、本申请的实施方案提供了经工程改造的融合逆转录酶，该经工程改造的融合逆转录酶包含：至少一个dna结合结构域(dbd)，该至少一个dbd选自包含古细菌dna结合结构域和单链dna结合结构域的dna结合结构域的组；以及具有与seq id no:1至少90％相同的氨基酸序列的经工程改造的逆转录酶，其中该经工程改造的逆转录酶包含如被索引至seq idno:7的m39突变、k47突变、l435突变、d449突变、d524突变、e607突变、d653突变和l671突变。在一个实施方案中，与具有seq id no:1中所示的氨基酸序列的逆转录酶相比，经工程改造的融合逆转录酶表现出改变的逆转录酶相关活性。在各个方面，至少一个dna结合结构域位于经工程改造的融合逆转录酶氨基酸序列的c端或n端。
3、在某些方面，dna结合结构域(dbd)的氨基酸序列包含具有seq id no:2的dna结合结构域。在各个方面，dbd是选自包含sto7d、sso7d、sis7b、sis7a、ssh7b、sto7、aho7c、aho7b、aho7a、mcu7、mse7、sac7e和sac7d的组的古细菌dna结合结构域。在一些方面，dna结合结构域是单链dna结合结构域。
4、在一些方面，dna结合结构域表现出降低的rna酶活性。在各个方面，已改变dna结合结构域的氨基酸序列以降低rna酶活性。dna结合结构域的氨基酸序列的改变可以选自包含k13突变、k13l突变、d36突变和d36l突变的改变组。
5、在一些方面，经工程改造的融合逆转录酶的氨基酸序列在经工程改造的融合逆转录酶的c端包含sto7 dna结合结构域。在一个方面，经工程改造的逆转录酶的氨基酸序列包含选自seq id no:3、seq id no:5、seq id no:6和seq id no:8中所示的氨基酸序列的组的氨基酸序列。
6、在经工程改造的融合逆转录酶的各个方面，经工程改造的逆转录酶的氨基酸序列还可以包含m39v突变和m66l突变中的一者或多者，其中该突变被索引至seq id no:7中所示的野生型mmlv的氨基酸序列。
7、在本文所提供的经工程改造的融合逆转录酶的各个方面，改变的逆转录酶相关活性选自包括持续合成能力、模板转换效率和化学耐受性的逆转录酶活性的组。在一个方面，与具有seq id no:1中所示的氨基酸序列的逆转录酶的模板转换效率相比，改变的逆转录酶相关活性是改变的模板转换(ts)效率。在各个方面，改变的模板转换效率比具有seq idno:1中所示的氨基酸序列的经工程改造的逆转录酶所表现出的模板转换效率高至少0.5倍。
8、在各个方面，经工程改造的融合逆转录酶包含至少两个融合结构域。在某些方面，至少一个融合结构域位于氨基酸序列的n端，并且至少一个融合结构域位于氨基酸序列的c端。在一些方面，至少两个融合结构域位于氨基酸序列的相同末端。在一些方面，位于氨基酸序列的n端的融合结构域与位于氨基酸序列的c端的融合结构域相同。在一个方面，位于氨基酸序列的n端的融合结构域是sso7d，并且位于氨基酸序列的c端的融合结构域是sso7d。在一个方面，位于n端的融合结构域是sso7d，而位于c端的融合结构域是sto7。在一个方面，位于氨基酸序列的n端的融合结构域是sto7，并且位于氨基酸序列的c端的融合结构域是sto7。在一个方面，位于n端的融合结构域是sto7，而位于c端的融合结构域是sso7d。
9、本文所提供的经工程改造的融合逆转录酶表现出改变的逆转录酶相关活性。在各个方面，与具有seq id no:1中所示的氨基酸序列的逆转录酶的转录效率相比，改变的逆转录酶相关活性是增加的转录效率。在各个方面，与具有seq id no:1中所示的氨基酸序列的逆转录酶相比，改变的逆转录酶相关活性是增加的转录效率和增加的模板转换效率。在一些方面，与具有seq id no:1中所示的氨基酸序列的逆转录酶的持续合成能力相比，改变的逆转录酶相关活性是改变的持续合成能力。在某些方面，与具有seq id no:1中所示的氨基酸序列的逆转录酶的线粒体umi计数相比，改变的逆转录酶相关活性是线粒体umi计数的增加。在各个方面，与具有seq id no:1中所示的氨基酸序列的逆转录酶的核糖体umi计数相比，改变的逆转录酶相关活性是核糖体umi计数的增加。在各方面，与包含具有seq id no:1中所示的氨基酸序列的逆转录酶的反应相比，改变的逆转录酶相关活性是产生中值umi/细胞的能力增加。
10、本申请的实施方案提供了经工程改造的融合逆转录酶，其中经工程改造的逆转录酶具有与seq id no:1中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，并且其中经工程改造的逆转录酶的氨基酸序列包含被索引至seq id no:7的至少一个突变，该至少一个突变选自由以下突变组成的组：m17突变；a32突变、m44突变、m39v突变、k47突变、p51突变、m66突变、s67突变、e69突变、l72突变、w94突变、k103突变、r110突变、p117突变、l139突变、n178突变、e179突变、t197突变、d200突变、e201突变、h204突变、q221突变、v223本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种经工程改造的融合逆转录酶，包含：至少一个DNA结合结构域，所述至少一个DNA结合结构域选自包含古细菌DNA结合结构域和单链DNA结合结构域的DNA结合结构域的组；以及具有与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列的经工程改造的逆转录酶，其中所述经工程改造的逆转录酶包含如被索引至SEQ ID NO:7的M39突变、K47突变、L435突变、D449突变、D524突变、E607突变、D653突变和L671突变。
2.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中与具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的逆转录酶相比，所述经工程改造的融合逆转录酶表现出改变的逆转录酶相关活性。
3.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述至少一个DNA结合结构域位于所述经工程改造的融合逆转录酶的C端或N端。
4.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述DNA结合结构域的所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:2中所示的DNA结合结构域共有基序。
5.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述D
6.根据权利要求1所述的经工程改造的逆转录酶，其中所述DNA结合结构域是单链DNA结合结构域。
7.根据权利要求1所述的经工程改造的逆转录酶，其中所述DNA结合结构域表现出降低的RNA酶活性。
8.根据权利要求7所述的经工程改造的逆转录酶，其中已改变所述DNA结合结构域的所述氨基酸序列以降低RNA酶活性。
9.根据权利要求8所述的经工程改造的逆转录酶，其中所述DNA结合结构域的所述氨基酸序列的所述改变选自包含K13突变、K13L突变、D36突变和D36L突变的组。
10.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述经工程改造的融合逆转录酶的所述氨基酸序列在所述经工程改造的融合逆转录酶的C端包含Sto7 DNA结合结构域。
11.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述经工程改造的逆转录酶的所述氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的组的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述经工程改造的逆转录酶的所述氨基酸序列还包含至少一个突变，所述至少一个突变选自包含M39V突变和M66L突变的组，其中所述突变被索引至SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求2所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述改变的逆转录酶相关活性选自包括持续合成能力、模板转换效率和化学耐受性的逆转录酶相关活性的组。
14.根据权利要求13所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中与具有SEQ ID NO:1中所示的所述氨基酸序列的逆转录酶的所述模板转换效率相比，所述改变的逆转录酶相关活性是改变的模板转换(TS)效率。
15.根据权利要求13所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述改变的模板转换效率比具有SEQ ID NO:1中所示的所述氨基酸序列的经工程改造的逆转录酶所表现出的所述模板转换效率高至少0.5倍。
16.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，包含至少两个融合结构域。
17.根据权利要求16所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中至少一个融合结构域位于所述氨基酸序列的N端，并且至少一个融合结构域位于所述氨基酸序列的C端。
18.根据权利要求16所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中至少两个融合结构域位于相同末端。
19.根据权利要求17所述的经工程改造的融合逆转录酶，其选自包含以下的经工程改造的融合逆转录酶的组：其中位于所述氨基酸序列的N端的所述融合结构域是Sso7D且位于所述氨基酸序列的C端的所述融合结构域是Sso7d的经工程改造的融合逆转录酶，以及其中位于所述氨基酸序列的N端的所述融合结构域是Sto7且位于所述氨基酸序列的C端的所述融合结构域是Sto7的经工程改造的融合逆转录酶。
20.根据权利要求16所述的经工程改造的融合逆转录酶，其选自包含以下的融合逆转录酶的组：其中位于所述氨基酸序列的N端的所述融合结构域是Ss07d且位于所述氨基酸序列的C端的所述融合结构域是Sto7的经工程改造的融合逆转录酶，以及其中位于所述氨基酸序列的N...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种经工程改造的融合逆转录酶，包含：至少一个dna结合结构域，所述至少一个dna结合结构域选自包含古细菌dna结合结构域和单链dna结合结构域的dna结合结构域的组；以及具有与seq id no:1至少90％相同的氨基酸序列的经工程改造的逆转录酶，其中所述经工程改造的逆转录酶包含如被索引至seq id no:7的m39突变、k47突变、l435突变、d449突变、d524突变、e607突变、d653突变和l671突变。
2.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中与具有seq id no:1中所示的氨基酸序列的逆转录酶相比，所述经工程改造的融合逆转录酶表现出改变的逆转录酶相关活性。
3.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述至少一个dna结合结构域位于所述经工程改造的融合逆转录酶的c端或n端。
4.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述dna结合结构域的所述氨基酸序列包含seq id no:2中所示的dna结合结构域共有基序。
5.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述dna结合结构域是选自包含sto7d、sso7d、sis7b、sis7a、ssh7b、sto7、aho7c、aho7b、aho7a、mcu7、mse7、sac7e和sac7d的组的古细菌dna结合结构域。
6.根据权利要求1所述的经工程改造的逆转录酶，其中所述dna结合结构域是单链dna结合结构域。
7.根据权利要求1所述的经工程改造的逆转录酶，其中所述dna结合结构域表现出降低的rna酶活性。
8.根据权利要求7所述的经工程改造的逆转录酶，其中已改变所述dna结合结构域的所述氨基酸序列以降低rna酶活性。
9.根据权利要求8所述的经工程改造的逆转录酶，其中所述dna结合结构域的所述氨基酸序列的所述改变选自包含k13突变、k13l突变、d36突变和d36l突变的组。
10.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述经工程改造的融合逆转录酶的所述氨基酸序列在所述经工程改造的融合逆转录酶的c端包含sto7 dna结合结构域。
11.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述经工程改造的逆转录酶的所述氨基酸序列包含选自seq id no:3、seq id no:5、seq id no:6和seq id no:8中所示的氨基酸序列的组的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述经工程改造的逆转录酶的所述氨基酸序列还包含至少一个突变，所述至少一个突变选自包含m39v突变和m66l突变的组，其中所述突变被索引至seq id no:7中所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求2所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述改变的逆转录酶相关活性选自包括持续合成能力、模板转换效率和化学耐受性的逆转录酶相关活性的组。
14.根据权利要求13所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中与具有seq id no:1中所示的所述氨基酸序列的逆转录酶的所述模板转换效率相比，所述改变的逆转录酶相关活性是改变的模板转换(ts)效率。
15.根据权利要求13所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中所述改变的模板转换效率比具有seq id no:1中所示的所述氨基酸序列的经工程改造的逆转录酶所表现出的所述模板转换效率高至少0.5倍。
16.根据权利要求1所述的经工程改造的融合逆转录酶，包含至少两个融合结构域。
17.根据权利要求16所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中至少一个融合结构域位于所述氨基酸序列的n端，并且至少一个融合结构域位于所述氨基酸序列的c端。
18.根据权利要求16所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中至少两个融合结构域位于相同末端。
19.根据权利要求17所述的经工程改造的融合逆转录酶，其选自包含以下的经工程改造的融合逆转录酶的组：其中位于所述氨基酸序列的n端的所述融合结构域是sso7d且位于所述氨基酸序列的c端的所述融合结构域是sso7d的经工程改造的融合逆转录酶，以及其中位于所述氨基酸序列的n端的所述融合结构域是sto7且位于所述氨基酸序列的c端的所述融合结构域是sto7的经工程改造的融合逆转录酶。
20.根据权利要求16所述的经工程改造的融合逆转录酶，其选自包含以下的融合逆转录酶的组：其中位于所述氨基酸序列的n端的所述融合结构域是ss07d且位于所述氨基酸序列的c端的所述融合结构域是sto7的经工程改造的融合逆转录酶，以及其中位于所述氨基酸序列的n端的所述融合结构域是sto7且位于所述氨基酸序列的c端的所述融合结构域是ss07d的经工程改造的融合逆转录酶。
21.根据权利要求2所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中与具有seq id no:1中所示的所述氨基酸序列的逆转录酶的所述转录效率相比，改变的逆转录酶相关活性是增加的转录效率。
22.根据权利要求2所述的经工程改造的融合逆转录酶，其中与具有seq id no:1中所示的所述氨基酸序列的逆转录酶相比，所述改变的逆转录...
【专利技术属性】
技术研发人员：尚卡尔·沙斯特里，德里克·H·瓦莱若，
申请(专利权)人：一零X基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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