【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物催化，具体一种新型酮还原酶突变体及其制备方法与应用。
技术介绍
1、趋化因子受体ccr2存在于免疫细胞表面，是gpcr受体家族的一员，能引导免疫细胞到达炎症部位，增强炎症反应。当趋化因子与ccr2结合后，介导单核细胞和淋巴细胞向炎症部位迁移。在单核细胞进入炎症组织并分化为巨噬细胞后，会释放促炎调节剂而增强炎症反应。如果能够抑制mcp-1和ccr2之间的结合，就可以抑制炎症反应。ccr2拮抗剂可以与ccr2结合而阻断趋化因子与ccr2的结合，从而达到预防、治疗或改善由mcp-1诱导的单核细胞和淋巴细胞迁移到炎症部位的ccr2介导的疾病。
2、(r)-4,4-二甲氧基四氢-2h-吡喃-3-醇是制备ccr2拮抗剂过程中的一种重要手性中间体，开发其廉价高效的合成方法，对预防、治疗或改善炎性综合征疾病具有重要意义。
3、现有报道中，合成(r)-4,4-二甲氧基四氢-2h-吡喃-3-醇的方法主要包括化学合成法和生物合成发。其中，化学合成法往往利用价格昂贵的过渡金属催化剂，伴其而生的还有催化效率低，产品手性纯度差等不利因素。对于生物合成法，虽有文献报道使用酮还原酶催化这一反应，但所用酮还原酶的序列不为公众所知，不便进行后续的工艺升级。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是，提供一种催化活力提高的酮还原酶突变体及其制备方法与应用。该酮还原酶突变体可以高效、高选择性的转化目标反应，且该突变体更加容易获得。
2、本专利技术为解决上述技术问题所采用的
3、本专利技术提供一种新型的酮还原酶突变体，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是与seq id no：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，且至少包括如下突变位点之一：第94位的丙氨酸突变为天冬氨酸；第145位的谷氨酸突变为苯丙氨酸；第147位的苯丙氨酸突变为甲硫氨酸，第190位的酪氨酸突变为脯氨酸，第206位的甲硫氨酸突变为色氨酸。
4、作为优选实施方式，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列为与seq id no：4、seq idno：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：12、seq id no：14、seq id no：16所示的氨基酸序列具有95％以上同源性，优选为96％的同源性，更优选为97％，98％，99％或100％的同源性的氨基酸系列。
5、本专利技术还提供一种酮还原酶突变体基因，所述酮还原酶突变体基因编码所述的酮还原酶突变体。
6、作为优选实施方式，所述酮还原酶突变体基因的序列为与seq id no：3、seq idno：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15所示的序列具有95％以上同源性，优选为96％的同源性，更优选为97％，98％，99％或100％的同源性的氨基酸系列。
7、本专利技术还提供一种重组质粒，所述重组质粒含有所述的酮还原酶突变体基因。
8、作为优选实施方式，所述重组质粒包括pet系列、pqe系列、prset系列、pgex系列、pbv系列、ptrc系列、ptwin系列、pezz系列、pkk系列、puc系列、ppic系列、phil系列以及pyam系列，优选pet-28a。
9、本专利技术还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的重组质粒。
10、作为优选实施方式，所述宿主细胞选自大肠杆菌基因工程菌或酵母菌基因工程菌。
11、本专利技术还提供一种生产(r)-4,4-二甲氧基四氢-2h-吡喃-3-醇的方法，包括酮还原酶对酮类化合物进行催化还原反应的步骤，所述酮还原酶为所述的酮还原酶突变体。
12、作为优选实施方式，所述酮类化合物为4,4-二甲氧基二氢-2h-吡喃-3(4h)-酮，所述4,4-二甲氧基二氢-2h-吡喃-3(4h)-酮的浓度为10～250g/l；所述还原反应的产物为(r)-4,4-二甲氧基四氢-2h-吡喃-3-醇。
13、作为优选实施方式，所述4,4-二甲氧基二氢-2h-吡喃-3(4h)-酮的转化率大于99％；ee值为大于99％，优选ee值为99.9％。
14、作为优选实施方式，所述酮还原酶为所述的酮还原酶突变体的酶粉、或含有所述酮还原酶突变体的全细胞或细胞破碎液。
15、作为优选实施方式，所述酮还原酶突变体的酶粉的浓度为1～10g/l；所述酮还原酶细胞浓度为5～50g/l。
16、作为优选实施方式，所述催化还原反应还包括辅因子，所述辅因子选自nadp+或nadph中的一种或二者的混合物，所述辅因子的浓度为0.05～1g/l。
17、作为优选实施方式，所述催化还原反应在缓冲液中进行，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或tris-盐酸缓冲液，所述缓冲液的浓度为50～500mmol/l。
18、作为优选实施方式，所述催化还原反应在ph 5.5～8.5，温度25～45℃条件下进行。
19、与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
20、本专利技术提供该突变体相比于野生型的酶在催化4,4-二甲氧基二氢-2h-吡喃-3(4h)-酮转化为(r)-4,4-二甲氧基四氢-2h-吡喃-3-醇的过程中活性和选择性均有提高，使得整个过程效率高，成本低，可应用于工业化生产。
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1.一种新型的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，且至少包括如下突变位点之一：第94位的丙氨酸突变为天冬氨酸；第145位的谷氨酸突变为苯丙氨酸；第147位的苯丙氨酸突变为甲硫氨酸，第190位的酪氨酸突变为脯氨酸，第206位的甲硫氨酸突变为色氨酸。
2.根据权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列为与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有95％以上同源性，优选为96％的同源性，更优选为97％，98％，99％或100％的同源性的氨基酸系列。
3.一种酮还原酶突变体基因，其特征在于，所述酮还原酶突变体基因编码权利要求1或2所述的酮还原酶突变体。
4.根据权利要求3所述的酮还原酶突变体基因，其特征在于，所述酮还原酶突变体基因的序列为与SEQ ID NO：3、SEQ ID
5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求3或4所述的酮还原酶突变体基因；所述重组质粒包括pET系列、pQE系列、pRSET系列、pGEX系列、pBV系列、pTrc系列、pTwin系列、pEZZ系列、pKK系列、pUC系列、pPIC系列、pHIL系列以及pYAM系列。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的重组质粒；所述宿主细胞选自大肠杆菌基因工程菌或酵母菌基因工程菌。
7.一种生产(R)-4,4-二甲氧基四氢-2H-吡喃-3-醇的方法，包括酮还原酶对酮类化合物进行催化还原反应的步骤，其特征在于，所述酮还原酶为权利要求1或2所述的酮还原酶突变体；
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酮还原酶为权利要求1或2所述的酮还原酶突变体的酶粉、或含有所述酮还原酶突变体的全细胞或细胞破碎液；所述酮还原酶突变体的酶粉的浓度为1～10g/L；所述酮还原酶细胞浓度为5～50g/L。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应还包括辅因子，所述辅因子选自NADP+或NADPH中的一种或二者的混合物，所述辅因子的浓度为0.05～1g/L。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化还原反应在pH5.5～8.5，温度25～45℃条件下进行。
...【技术特征摘要】
1.一种新型的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是与seq id no：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，且至少包括如下突变位点之一：第94位的丙氨酸突变为天冬氨酸；第145位的谷氨酸突变为苯丙氨酸；第147位的苯丙氨酸突变为甲硫氨酸，第190位的酪氨酸突变为脯氨酸，第206位的甲硫氨酸突变为色氨酸。
2.根据权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列为与seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：12、seq idno：14、seq id no：16所示的氨基酸序列具有95％以上同源性，优选为96％的同源性，更优选为97％，98％，99％或100％的同源性的氨基酸系列。
3.一种酮还原酶突变体基因，其特征在于，所述酮还原酶突变体基因编码权利要求1或2所述的酮还原酶突变体。
4.根据权利要求3所述的酮还原酶突变体基因，其特征在于，所述酮还原酶突变体基因的序列为与seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：11、seq idno：13、seq id no：15所示的序列具有95％以上同源性，优选为96％的同源性，更优选为97％，98％，99％...
【专利技术属性】
技术研发人员：王留柱，朱双全，仇怡，吴嗣林，
申请(专利权)人：上海泓博尚奕药物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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