【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于结核分枝杆菌耐药基因突变检测领域，在耐药早期阶段，通过检测超低频突变，实现高危耐药患者监测和耐药结核预警，具体是一种对超低比例利福平耐药突变定量检测的试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、耐药结核病有治愈率低、死亡率高的特点。异质性耐药，是指样本中耐药菌和敏感菌共存，且耐药菌比例≤1％的状态。临床实践中，药物敏感结核患者体内的菌群一旦发生异质性耐药，耐药菌比例往往会逐渐升高并最终成为优势菌，该患者就由药物敏感结核变成耐药结核。因此异质性耐药是耐药结核发生的早期阶段，也是防控干预的关键窗口期。对耐药结核高危病例进行异质性耐药水平动态监测及早期预警，是实现早期干预和控制耐药结核传播的重要手段。异质性耐药阶段，由于耐药菌占比例低，存在检测难度大和定量检测难以实现等困难。
2、传统的表型耐药检测是判断结核耐药的金标准，理论上可检测出耐药比例≥1％的异质性耐药菌群，但实践中一般需5％以上比例才可稳定检出，且存在耗时长和对检测场所有严格的生物安全要求等缺点，难以满足快速检测需求，不利于耐药早期发现和传播防控。随着分子检测技术的快速发展，基因型药敏开始应用于科研和临床，其可通过检测结核分枝杆菌基因组特定区域来实现预测耐药。但现有的基因型药敏技术的对检出耐药亚群的灵敏度远低于表型药敏。
3、例如，who推荐的lipa核酸杂交探针技术可检出的耐药比例在5％-50％，xpert-mtb/rif可检出的耐药比例约为60％，熔解曲线法可检出的耐药比例为20～30％。近年来新兴的核酸质谱技术可检出耐药比例虽高于20％，但
技术实现思路
1、本专利技术针对上述问题，提供一种对超低比例利福平耐药突变定量检测的试剂盒及检测方法，能够发挥数字pcr灵敏、定量的优势，实现了检测总拷贝数10-1000/微升，耐药突变比例低至0.5％稳定检出，满足临床耐药结核早期预警的检测需求。
2、为此，本专利技术采取如下技术方案：对超低比例利福平耐药突变定量检测的试剂盒，其特征在于包括靶向结核分枝杆菌rpob耐药突变位点和内参基因的引物及探针，所述内参基因的通道选择了katg基因的保守区域，设计了上游引物，下游引物和探针序列；靶向结核分枝杆菌rpob的基因区域设计了特异性突变位点的上游引物序列，通用下游引物和探针序列；所述的特异性突变位点包括rpobl430p、rpobh445y、rpobh445r、rpobd435y、rpobh445d、rpobh445l、rpobs450l和rpobs450w。
3、作为优选，所述特异性突变位点的上游引物序列在3’端倒数第2位或第3位碱基处引入一个错配碱基。本专利技术中，该错配碱基与3’末端的错配碱基共同作用，使引物在与其3’末端不互补的模板中扩增产物率显著降低，而引物在与其3’末端互补的模板中正常扩增。
4、作为优选，还包括数字pcr反应试剂，引物探针对，其中所述数字pcr反应试剂包括pcr缓冲液、taq dna聚合酶、hex染料和无核酸酶水。
5、作为优选，所述靶向结核分枝杆菌rpob的基因区域设计特异性突变位点的上游引物序列，通用下游引物和探针序列的具体信息如下：
6、
7、本专利技术还公开了一种对超低比例利福平耐药突变定量检测方法，通过上述的试剂盒对核酸样品进行检测。
8、采用katg基因作为内对照位点，并对结核分枝杆菌利福平耐药基因rpob的8个热点突变型检测，通过计算每个位检测值与katg基因内参检测值的比值来判定样品中是否含有结核分枝杆菌dna以及携带利福平耐药基因突变的耐药菌占比。
9、作为优选，本专利技术还包括多重反应体系以对样品经前处理提取获得基因组dna。
10、作为优选，检测体系的反应程序包括98℃5min；然后98℃15s，60℃1min，40个循环；25℃10min。
11、本专利技术的有益效果是：
12、(1)本专利技术是一项适用于耐药结核早期检测和高危耐药患者动态监测的技术。解决了目前早期耐药阶段，低比例突变难以检测，耐药预警困难的临床问题。
13、(2)本专利技术不仅实现了耐药早期检测，由于基于数字pcr平台设计的试剂盒有很高的灵敏度，对病原检出也有较高的检出率。
14、(3)本专利技术具有定量、灵敏、快速、高通量的优势，检测成本低，适合高危耐药患者动态监测，且可操作性强，较易推广应用。
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1.对超低比例利福平耐药突变定量检测的试剂盒，其特征在于包括靶向结核分枝杆菌rpoB耐药突变位点和内参基因的引物及探针，所述内参基因的通道选择了KatG基因的保守区域，设计了上游引物，下游引物和探针序列；靶向结核分枝杆菌rpoB的基因区域设计了特异性突变位点的上游引物序列，通用下游引物和探针序列；所述的特异性突变位点包括rpoBL430P、rpoBH445Y、rpoBH445R、rpoBD435Y、rpoBH445D、rpoBH445L、rpoBS450L和rpoBS450W。
2.根据权利要求1所述的对超低比例利福平耐药突变定量检测的试剂盒，其特征在于所述特异性突变位点的上游引物序列在3’端倒数第2位或第3位碱基处引入一个错配碱基。
3.根据权利要求2所述的对超低比例利福平耐药突变定量检测的试剂盒，其特征在于还包括数字PCR反应试剂，引物探针对，其中所述数字PCR反应试剂包括PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、HEX染料和无核酸酶水。
4.根据权利要求1-3任一所述的对超低比例利福平耐药突变定量检测的试剂盒，其特征在于所述靶向结核分枝杆菌rp
5.一种对超低比例利福平耐药突变定量检测方法，其特征在于采用权利要求1-4任一所述的试剂盒对核酸样品进行检测。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于采用KatG基因作为内对照位点，并对结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的8个热点突变型检测，通过计算每个位检测值与KatG基因内参检测值的比值来判定样品中是否含有结核分枝杆菌DNA以及携带利福平耐药基因突变的耐药菌占比。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于包括多重检测体系，所述的检测体系如下：
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述检测体系的反应程序包括98℃5min；然后98℃15s，60℃1min，40个循环；25℃10min。
...【技术特征摘要】
1.对超低比例利福平耐药突变定量检测的试剂盒，其特征在于包括靶向结核分枝杆菌rpob耐药突变位点和内参基因的引物及探针，所述内参基因的通道选择了katg基因的保守区域，设计了上游引物，下游引物和探针序列；靶向结核分枝杆菌rpob的基因区域设计了特异性突变位点的上游引物序列，通用下游引物和探针序列；所述的特异性突变位点包括rpobl430p、rpobh445y、rpobh445r、rpobd435y、rpobh445d、rpobh445l、rpobs450l和rpobs450w。
2.根据权利要求1所述的对超低比例利福平耐药突变定量检测的试剂盒，其特征在于所述特异性突变位点的上游引物序列在3’端倒数第2位或第3位碱基处引入一个错配碱基。
3.根据权利要求2所述的对超低比例利福平耐药突变定量检测的试剂盒，其特征在于还包括数字pcr反应试剂，引物探针对，其中所述数字pcr反应试剂包括pcr缓冲液、taq dna聚合酶、hex染料和无核酸酶水。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：沙巍，王丽，张育杰，罗辉，
申请(专利权)人：上海市肺科医院上海市职业病防治院，
类型：发明
国别省市：
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