【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及种子科学领域，特别是关于一种玉米单粒种子根鞘内源β-甘露聚糖酶活性检测方法。
技术介绍
1、种子萌发始于静态的吸胀作用，然后种子胚轴伸长，最终被覆物破裂胚根伸出完成种子萌发。从生物力学角度来看，能否完成种子（包括果实）萌发关键取决于下述两种相反作用力下的平衡状态：胚轴（包括胚根-下胚轴生长区）的生长潜力和种子覆盖层（包括胚乳、种皮和果皮）的力学限制。不同种子组分之间的相互力学作用是从种子发育到萌发完成的关键因素，生物力大小变化往往伴随着组织内各种生理生化变化。
2、种子作为重要的植物系统，其细胞壁的松弛和各种覆盖层的弱化均介导调节胚的生长和胚根的伸出。胚乳弱化是胚根伸出的先决条件，胚乳弱化现象在辣椒、番茄、甜瓜、咖啡、独荇菜等植物种子萌发过程中普遍存在。我们团队对该方向也已开展了大量研究工作（the seed biology place，http://www.seedbiology.de/index.html）。相关研究表明种子珠孔胚乳弱化受环境和激素调节，涉及细胞壁重塑蛋白的组织特异性表达和质外体活性氧的产生等因素（steinbrecher t, leubner-metzger g. the biomechanics of seedgermination. journal of experimental botany, 2017, 68: 765-783.）。
3、种子萌发过程中，特定的植物细胞壁重塑对种子形态、生物力学和生理特性的多样性起着决定性的作用。胚乳细胞壁的化学组成一般情况下，纤
4、谷类（大麦、小麦、燕麦）、禾本科杂草（如普通的野生燕麦）和其他禾本科植物（禾本科）的繁殖体（含种子的散布单位）与双子叶植物的种子有很大不同。它们是或包含颖果，以果实作为种子时，其果皮和种皮是融合（紧密结合）的，在许多情况下还被外壳覆盖。作为典型的禾本科颖果，胚芽鞘包含着胚芽，胚根鞘包裹着胚根。珠孔胚乳对双子叶植物种子休眠和萌发起重要作用，而禾本科植物取而代之的是胚根鞘，一种非管化胚器官，种子吸胀萌发时，胚根鞘膨胀并从颖果（种子）中伸出，相关研究认为它在保护胚生长方面起到一定作用，但其弱化调控种子萌发的机理尚不清楚，非常值得深入研究（holloway t,steinbrecher t, pérez m, seville a, stock d, nakabayashi k, leubner-metzgerg. coleorhiza-enforced seed dormancy: a novel mechanism to controlgermination in grasses. new phytologist, 2021, 229: 2179-2191.）。
5、玉米是世界上最重要的粮饲作物之一。玉米种子萌发中，胚根鞘弱化调控能力直接关系着种子能否顺利完成正常萌发。β-甘露聚糖酶在玉米胚根鞘弱化中可能扮演与其他植物种子珠孔胚乳类似的角色，但在玉米种子萌发中根鞘内源β-甘露聚糖酶的活性变化特征尚不清楚，故研究玉米根鞘内源β-甘露聚糖酶的活性变化对探讨胚根鞘弱化调控种子萌发机理非常重要。由于根鞘组织分离存在技术困难，且样品量非常少，存在技术瓶颈，故目前尚未有关于玉米根鞘内源β-甘露聚糖酶活性定量检测的相关报道，其技术方法特别是单粒种子测定技术方法非常值得探索。
6、准确检测单粒玉米种子根鞘内源β-甘露聚糖酶活性是研究种子萌发中胚根鞘弱化机理的最关键内容之一。传统的β-甘露聚糖酶活性测定方法主要有黏度测定法和分光光度法。黏度测定法利用底物消化反应前后黏度的变化，对β-甘露聚糖酶活力进行测定。尽管可检测到较低的酶活，但同样易受β-甘露聚糖酶的同工酶影响，并且样品逐一检测，操作繁琐、耗时长、效率低；分光光度法主要利用3,5-二硝基水杨酸与还原糖在碱性条件下的颜色反应，对β-甘露聚糖酶活力进行测定。该方法尽管测定流程较简单、对部分种子测定效果较好，但粗酶液中除了β-甘本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种玉米单粒种子根鞘内源β-甘露聚糖酶活性检测方法，其特征在于包括以下作业：（1）种子发芽；（2）样品收集；（3）样品保存；（4）凝胶制作；（5）酶液提取；（6）水解反应；（7）显色反应；（8）信息采集；（9）标曲制作；（10）定量计算。所述作业（1）中，对玉米种子进行纸间发芽；所述作业（2）中，采取“萌发事件发生率+萌发时间”的方式记录取样时间点，采用“横竖切”和“多次轻压”方式进行根鞘组织分离；所述作业（3）中，利用微量滴定板或微量离心管进行根鞘组织低温保存；所述作业（4）中，经配制孵育缓冲液、加入半乳甘露聚糖底物和琼脂糖、加热倒皿、精细打孔等操作，完成凝胶检测板的制作；所述作业（5）中，利用提取缓冲液收集样品组织内源β-甘露聚糖酶，每样品加入20μl孵育缓冲液，于30℃黑暗孵育2h；所述作业（6）中，向直径3mm凝胶孔加入10μl酶液，30℃避光孵育20h；所述作业（7）中，刚果红染色液与凝胶底物结合反应后，用缓冲液洗涤以显现水解圈；所述作业（8）中，对水解圈进行图像采集（放置标准刻度）、信息提取；所述作业（9）中，利用β-甘露聚糖酶标准品制作β-甘露聚糖酶标准曲线；所
2.权利要求1所述的一种玉米单粒种子根鞘内源β-甘露聚糖酶活性检测方法，其特征在于：作业（5）包括扩散提取，研磨提取，先扩散后研磨三种提取方法，其中根鞘样品研磨采用“铝箔片压磨法”。
...【技术特征摘要】
1.一种玉米单粒种子根鞘内源β-甘露聚糖酶活性检测方法，其特征在于包括以下作业：（1）种子发芽；（2）样品收集；（3）样品保存；（4）凝胶制作；（5）酶液提取；（6）水解反应；（7）显色反应；（8）信息采集；（9）标曲制作；（10）定量计算。所述作业（1）中，对玉米种子进行纸间发芽；所述作业（2）中，采取“萌发事件发生率+萌发时间”的方式记录取样时间点，采用“横竖切”和“多次轻压”方式进行根鞘组织分离；所述作业（3）中，利用微量滴定板或微量离心管进行根鞘组织低温保存；所述作业（4）中，经配制孵育缓冲液、加入半乳甘露聚糖底物和琼脂糖、加热倒皿、精细打孔等操作，完成凝胶检测板的制作；所述作业（5）中，利用提取缓冲液收集样品组...
【专利技术属性】
技术研发人员：李贺勤，江绪文，岳海旺，格哈德·洛伊布纳，蒂娜·施泰因布雷彻，赵延明，鲁苗苗，贾濡，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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