【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体而言，涉及一种重组细胞及其构建方法和应用。
技术介绍
1、胰高血糖素样肽-1(glp-1)也称肠促胰素，是由小肠l细胞分泌，具有多器官靶向调控作用，包括促进胰岛激素分泌，抑制胰高血糖素释放，减缓胃排空，降低食欲，对营养摄取和促进营养吸收具有重要的调控作用。glp-1的生物作用主要通过激活glp-1受体(glp-1r)。glp-1r是一种g蛋白偶联的膜蛋白，主要在胰腺β细胞中表达，在其他组织和细胞(肺、心、肾、胃肠道和脑)中也有一定程度的表达。glp-1与受体结合后激活腺苷酸环化酶(ac)，从而刺激第二信使环磷酸腺苷(camp)生成，并与蛋白激酶a(pka)和camp调节的鸟嘌呤核苷酸交换因子(camp gefs)epac家族相结合[1]。
2、天然glp-1在人体内半衰期仅1-2分钟，主要是由于包括二肽基肽酶iv(dpp-iv)在内的快速酶失活[2]和/或肾清除率[3]所致。因此，科学家们研发了多种长效抗降解glp-1类似物，例如，人源glp-1类似物经过氨基酸替换[4,5]和/或n-末端修饰，包括脂肪酰化[6]n-乙酰化修饰[7]延长循环半衰期。白蛋白缀合的glp-1(阿必鲁肽)也具有延长的半衰期[8]。近年来，多种glp-1受体激动剂及其类似物已被广泛用于治疗糖脂代谢性疾病，尤其是2型糖尿病(t2dm)和肥胖症。glp-1受体激动剂在糖尿病治疗中发挥着重要的作用，而且对心血管疾病[9]和神经系统疾病[10,11]也起到了预防和治疗作用。此外，glp-1还可与肾脏、皮肤等的glp-1受体
3、美国专利us8658174公开了glp-1融合蛋白，其包含与igg/fc结构域融合的glp-1多肽，可用于治疗糖尿病。
4、研究表明，glp1-fc融合蛋白中存在翻译后修饰。hou等人2019年报道，细胞培养过程中增加烟酰胺和半胱氨酸有助于降低一种glp类似物与igg4/fc融合蛋白(度拉鲁肽)的羟基化水平[13]。
5、运用基因工程重组蛋白技术制作治疗用途的融合蛋白旨在表达具有天然多肽的属性，过程涉及转录、翻译和翻译后修饰的细胞工程步骤，其工艺直接影响药物的理化特征、构象、在体内半衰期、生物活性以及生产制作的产量等。因此，目前仍然需要改进的glp-1融合蛋白，例如适合大规模生产，具有更高的产量和活性以及更长的半衰期等特征以用于临床治疗，具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种具有更高的活性和产量的改进的glp-1融合蛋白，该融合蛋白可以通过多种途径或方式来获得，例如在特定蛋白位置选择氨基酸替换、进行羟基化、氧化等，如通过在glp-1多肽的k34上羟基化和/或减少glp-1多肽的氧化。此外，本专利技术的glp-1融合蛋白特定位置的氨基酸替换，使改进的融合蛋白半衰期显著延长，同时在人类疾病、动物疾病模型中具有良好的预防和治疗效果。
2、因此，本专利技术的优势在于提供了一种改进的glp-1融合蛋白，具有产量和活性提高、或半衰期延长的特性。
3、本专利技术的一个方面，提供了一种glp-1融合蛋白，所述融合蛋白包含glp-1多肽和免疫球蛋白fc结构域，其中所述glp-1多肽选自人glp-1(7-37)、人glp-1(7-36)和dppiv抗性人glp-1，所述glp-1多肽与免疫球蛋白fc结构域共价连接，其中所述glp-1多肽包含a8g和/或g22e和/或r36g替换，所述免疫球蛋白fc结构域包括或者为igg2/fc结构域，所述igg2/fc结构域包含c222s替换，和/或所述igg2/fc结构域还包含选自a330s替换和p331s替换中的一种或两种。
4、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白中，所述glp-1多肽在相对于天然人glp-1的k34上具有一定水平的羟基化。优选地，所述羟基化水平在10％和100％之间，例如大于等于10％、或至少大于等于20％、或大于等于26％、或大于等于30％、或大于等于40％、或大于等于50％，或大于等于60％，或大于等于70％，或大于等于80％，或大于等于90％。
5、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白中，免疫球蛋白fc结构域(igg2/fc)中在相对于天然igg2的第251位蛋氨酸(m251)和/或glp-1多肽中在相对于天然glp-1的第31位色氨酸(w31)氧化程度降低。在另一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白中，igg2/fc中的第251位蛋氨酸(m251)和/或glp-1多肽中在相对于天然glp-1的第31位色氨酸(w31)在一定程度上被氧化。优选地，m251上氧化水平小于约5％、小于等于约4％、小于等于约3％或小于等于约2％，和/或w31上的氧化水平低于约0.5％或无法检测。
6、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白中，所述glp-1多肽具有与seq idno:1或seq id no:2或seq id no:3至少90％序列相同性并且包括a8g和/或g22e和/或r36g替换的氨基酸序列。
7、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白中，所述igg2/fc结构域具有与seqid no:5或seq id no:6至少90％序列相同性并且包含a330s和/或p331s替换，并且包含c222s替换的氨基酸序列。
8、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白中，所述融合蛋白还包含用于连接所述glp-1多肽和所述免疫球蛋白fc结构域的连接肽。
9、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白中，所述连接肽具有选自seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18和seq id no:19中的任一氨基酸序列，优选seq id no:9。
10、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白具有seq id no:7的氨基酸序列或与seq id no:7具有至少约90％序列相同性的氨基酸序列。
11、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白中还包含信号肽。优选地，所述信号肽是人cd33信号肽，或者所述信号肽具有seq id no:4的氨基酸序列或与seq id no:4具有至少约90％序列相同性的氨基酸序列。
12、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白具有与seq id no:8至少约90％序列相同性的氨基酸序列。
13、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白药品级的。
14、在一个实施方式中，本专利技术的glp-1融合蛋白中，所述glp-1多肽的氨基酸序列与seq id no:1或seq id no:2具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组细胞，其包含编码GLP-1融合蛋白的多核苷酸，其中，所述GLP-1融合蛋白包含GLP-1多肽和免疫球蛋白Fc结构域，其中所述GLP-1多肽选自人GLP-1(7-37)、人GLP-1(7-36)和DPPIV抗性人GLP-1，所述GLP-1多肽与免疫球蛋白Fc结构域共价连接，其中所述GLP-1多肽包含相对于天然人GLP-1的A8G和/或G22E和/或R36G替换，所述免疫球蛋白Fc结构域包含或为IgG2/Fc结构域，所述IgG2/Fc结构域包含C222S替换，和/或所述IgG2/Fc结构域还包含选自A330S替换和P331S替换中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其还重组或天然表达赖氨酰羟化酶，优选地，其与COS-7细胞相比赖氨酰羟化酶活性水平增加，更优选地，其由中国仓鼠卵巢细胞，特别是CHOK1细胞得到。
3.根据权利要求1或2所述的重组细胞，
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中，所述GLP-1融合蛋白还包含用于连接所述GLP-1多肽和所述免疫球蛋白Fc结构域的连接肽，优选地，所述连接肽具有SEQ ID
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组细胞，其中，所述GLP-1融合蛋白具有SEQ IDNO：7的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7具有至少90％序列相同性的氨基酸序列，
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组细胞，其中，所述编码GLP-1融合蛋白的多核苷酸具有SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27具有至少70％的序列相同性的多核苷酸序列。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的重组细胞的构建方法，包括：将编码所述GLP-1融合蛋白的多核苷酸引入载体中以构建表达载体；将所述表达载体导入重组或天然表达赖氨酰羟化酶的细胞以得到重组细胞，
8.一种重组细胞的构建方法，包括：将SEQ ID NO:26所示的多核苷酸序列插入pKN012载体的NcoI和HindIII位点，生成pKN012-GLP-1-IgG2/Fc；
9.一种生产GLP-1融合蛋白的方法，包括使用如权利要求1-6中任一项所述的重组细胞或如权利要求7或8所述的构建方法制备的重组细胞得到GLP-1融合蛋白的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中：
...【技术特征摘要】
1.一种重组细胞，其包含编码glp-1融合蛋白的多核苷酸，其中，所述glp-1融合蛋白包含glp-1多肽和免疫球蛋白fc结构域，其中所述glp-1多肽选自人glp-1(7-37)、人glp-1(7-36)和dppiv抗性人glp-1，所述glp-1多肽与免疫球蛋白fc结构域共价连接，其中所述glp-1多肽包含相对于天然人glp-1的a8g和/或g22e和/或r36g替换，所述免疫球蛋白fc结构域包含或为igg2/fc结构域，所述igg2/fc结构域包含c222s替换，和/或所述igg2/fc结构域还包含选自a330s替换和p331s替换中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其还重组或天然表达赖氨酰羟化酶，优选地，其与cos-7细胞相比赖氨酰羟化酶活性水平增加，更优选地，其由中国仓鼠卵巢细胞，特别是chok1细胞得到。
3.根据权利要求1或2所述的重组细胞，
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中，所述glp-1融合蛋白还包含用于连接所述glp-1多肽和所述免疫球蛋白fc结构域的连接肽，优选地，所述连接肽具有seq idno:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq idno:15、seq id no:16、seq id...
【专利技术属性】
技术研发人员：王庆华，
申请(专利权)人：广州银诺医药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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