【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工和能源开采，特别涉及一种高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌基因工程菌、构建方法和应用。
技术介绍
1、石油是世界上重要的不可再生资源之一。经历利用天然能量进行开采的一次采油、注水开采的二次采油之后，仍有大量原油残留于地层，利用物理、化学和生物方法对于这部分原油进行开发的三次采油目前成为我国提高采收率的重要技术手段。微生物驱油是将微生物及产物注入地下来提高采收率的一种方法，将微生物代谢产生的生物表面活性剂或富含生物表面活性剂的发酵液注入地下进行微生物驱油、吞吐、清防蜡均属于微生物驱地面发酵法。生物表面活性剂是微生物代谢产生的集亲水极性基团和疏水基团于一体的两亲性物质，其于原油作用具有增溶、乳化、润湿、发泡、分散、降低表界面张力等性能从而有利于提高原油采收率，同时与化学表活剂相比，生物表活剂具有无毒环保、可生物降解、生态安全、表面活性高等特点。
2、鼠李糖脂类生物表活剂是石油开采中较常使用的糖脂类阴离子生物表面活性剂，其亲水基一般由1～2分子的鼠李糖环构成，疏水基则由1～2分子具有不同碳链长度饱和或不饱和脂肪酸构成。鼠李糖脂具有良好的乳化性能，表面活性高(降低表面张力至25～30mn/m)，临界胶束浓度低(40～150mg/l之间)，可生物降解、生态安全，产生菌种丰富，底物来源广泛，结构多样，应用范围较广，其对石油烃的去除及驱替效果优于化学表面活性剂，可用于微生物驱及含油污泥、污水的生物处理。鼠李糖脂类生物表面活性剂除用于石油工程之外，还可用于化工、医药、日化等领域。鼠李糖脂生物合成的糖基和脂基前体物质均依
3、目前对于鼠李糖脂的生物发酵仍存在自然筛选菌株发酵产量不高，从而影响生物表活剂生产规模及发酵生产成本，限制了以鼠李糖脂为主的驱油及洗油体系的大规模工业化应用，且从自然界筛选得到的野生鼠李糖脂生产菌株铜绿假单胞菌作为一株兼性厌氧菌，其在厌氧条件下不产或低产鼠李糖脂，增加了地面发酵成本、增加染菌率，并限制了其作为外源菌注入地下，以期能够在油藏中原位代谢产生鼠李糖脂的应用。
技术实现思路
1、针对上述问题，一方面，本专利技术提出了一种高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌基因工程菌，命名为铜绿假单胞菌wjpab，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.24852。
2、另一方面，本专利技术提出了一种铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
3、利用重组质粒pbbrporpab转化铜绿假单胞菌wj的感受态细胞，将得到的转化细胞培养后提取质粒；
4、对提取的质粒进行pcr，对pcr产物筛选阳性克隆得到铜绿假单胞菌基因工程菌。
5、进一步地，所述重组质粒pbbrporpab由铜绿假单胞菌wj的强启动子poprl和rhlab基因进行基因重叠pcr后，所得融合基因片段popr－rhlab与pbbr1mcs－5载体连接而成；
6、其中，所述强启动子poprl的核苷酸序列如seq id no.1所示；
7、所述rhlab基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8、进一步地，所述重组质粒pbbrporpab按照以下步骤构建：
9、以oprl的强启动子poprl替换rhlab基因的原始启动子，获得融合基因片段popr-rhlab并进行纯化；
10、将pbbr1mcs－5载体和纯化后的融合基因片段popr－rhlab分别进行酶切后，在dna连接酶催化下，将融合基因片段popr－rhlab连接在pbbr1mcs－5载体上得到连接产物；
11、利用所述连接产物转化e.col idh5α的感受态细胞，并对感受态细胞进行培养，利用pbbr1mcs－5载体上的引物m13－47/rv－m引物对细胞培养液进行pcr，得到重组质粒pbbrporpab。
12、进一步地，所述引物m13－47和rv－m的核苷酸序列分别如seq id no.7和seq idno.8所示。
13、进一步地，获得融合基因片段popr－rhlab包括以下步骤：
14、以铜绿假单胞菌wj的基因组为模板；
15、以引物rhlab－c1/rhlab－c2进行pcr扩增不包含启动子的rhlab基因片段，引物rhlab－c2引入hind iii酶切位点；以porp－1/porp－2为引物进行pcr扩增包含启动子poprl的dna片段，引物popr－1引入kpn i酶切位点；
16、以两个pcr产物的混合物为模板进行重叠pcr，即得融合基因片段popr－rhlab。
17、进一步地，所述引物rhlab－c1、rhlab－c2、porp－1和porp－2的核苷酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示。
18、本专利技术还提供了一种包含所述铜绿假单胞菌wjpab的发酵液/种子液。
19、进一步地，所述铜绿假单胞菌wjpab的种子液可以在制备鼠李糖脂表面活性剂上应用。
20、进一步地，所述铜绿假单胞菌wjpab的发酵液可以在原油采收中应用。
21、本专利技术的有益效果：
22、本专利技术所提供的铜绿假单胞菌基因工程菌株提高了鼠李糖脂产量，实验室摇瓶条件下发酵液中鼠李糖脂产量达到47.8g/l，与铜绿假单胞菌wj的最高鼠李糖脂产量14.9g/l相比提高了3.2倍。
23、本专利技术所提供的铜绿假单胞菌基因工程菌株使得原本厌氧条件下无鼠李糖脂代谢能力的铜绿假单胞菌wj产生了可在厌氧或少氧条件下代谢产生鼠李糖脂的能力，实验室摇瓶条件下厌氧产鼠李糖脂0.425g/l。
24、本专利技术所提供的铜绿假单胞菌基因工程菌株可稳定遗传10代，10代内可保证构建质粒及功能基因片段不丢失，产量无下降。
25、铜绿假单胞菌基因工程菌发酵液对原油有显著的乳化作用，可广泛乳化各种烃类，耐受高盐、高温和广泛ph的极端环境，能够很好的应用在采油及生态修复等领域。
26、本专利技术提供的铜绿假单胞菌基因工程菌可以将原油采收率提高至13.51％，显示出较强的驱油潜力。
27、本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
28、序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌基因工程菌，命名为铜绿假单胞菌WJPAB，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.24852。
2.一种如权利要求1所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，
4.根据权利要求2或3所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，
5.根据权利要求4所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，
6.根据权利要求4所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，
7.根据权利要求6所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，
8.一种包含权利要求1所述的铜绿假单胞菌WJPAB的发酵液/种子液。
9.一种按照权利要求2－7任一项所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法构建的铜绿假单胞菌WJPAB的发酵液/种子液。
10.一种如权利要求8或9所述的铜绿假单胞菌WJPAB的种子液在制备鼠李糖脂表面活性剂上
11.一种如权利要求8或9所述的铜绿假单胞菌WJPAB的发酵液在原油采收中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌基因工程菌，命名为铜绿假单胞菌wjpab，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.24852。
2.一种如权利要求1所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，
4.根据权利要求2或3所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，
5.根据权利要求4所述的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，
6.根据权利要求4所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：伊丽娜，张群，修建龙，黄佳，黄立信，马原栋，崔庆锋，王璐，俞理，
申请(专利权)人：中国石油天然气股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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