一种膀胱癌检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种膀胱癌检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒内包括

【技术实现步骤摘要】
一种膀胱癌检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物医学检验
，具体涉及一种膀胱癌检测试剂盒及膀胱癌检测方法
。

技术介绍

[0002]膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，新发病例约为
8.0
万例，死亡例数约为
3.3
万例，均位于恶性肿瘤第
13
位
。
其中，男性的发病率和死亡率远高于女性，发病率高居男性泌尿生殖系恶性肿瘤中第二位
。
近年来，我国膀胱癌的发病率和死亡率均呈上升趋势，防控形势不容乐观
。
全世界每年约有
55
万例新发病例和
20
万死亡病例
。
膀胱癌患者中约
80%
是非肌层浸润性膀胱癌（
non
‑
muscle
‑
invasive bladder cancer
，
NMIBC
），尽管不会危及生命，但其中
70%
的患者术后会出现肿瘤复发，
15%
的患者分期和分级会发生进展
。
因此，膀胱癌患者术后通常需要多次复查和膀胱灌注治疗，费用昂贵
。
[0003]中华医学会泌尿外科分会（
CUA
）
、
中国医师协会泌尿外科医师分会（
CUDA
）
、
中国抗癌协会泌尿男生殖系肿瘤专业委员会（
CACA
‑
GU
）在
2021
年发布的
《
中国膀胱癌诊断治疗指南
》
和
《
中国泌尿外科和男科疾病诊断治疗指南（
2019
版）
》
指出：
DNA
甲基化作为肿瘤表观遗传学修饰最为常见的方式，其检测在肿瘤分子诊断中具有重要前景
。
已有报道通过
PCR
技术对尿液中膀胱癌特定的
DNA
甲基化位点进行检测，在低级别和非肌层浸润性膀胱癌的敏感性明显优于尿脱落细胞学和
FISH
，展示良好的诊断结果，有望实现临床转化；尤其在早期
、
微小
、
残留和复发肿瘤诊断上具有显著优势，有望用于膀胱癌早期诊断
、
复发监测，为减少有创的膀胱镜检查和为二次电切手术提供科学依据
。
[0004]传统的检查方式不足以满足临床需求：金标准“膀胱镜检查
+
病理活检”是有创的检查方式，增加患者的痛苦导致其依从性不高；临床已应用多年的分子诊断技术尿液脱落细胞学及
FISH
等方法在敏感性和特异性方面不高，不能满足临床诊断的需求
。
而通过尿液脱落细胞的基因甲基化检测，实现了无创取样，增加了受检者的接受检测的依从性，减少了不必要的侵入性检查，从而对膀胱癌临床诊疗决策产生的积极影响，具有很高的临床价值
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的问题，本专利技术的目的是提供一种膀胱癌检测试剂盒及检测方法，通过对尿液细胞的
DHFR
基因点突变检测，及
Twist1
基因和
TSC21 基因甲基化联合检测来判断样本是否发生癌变，为临床提供一种操作简便又精准的膀胱癌筛查方式
。
[0006]本专利技术所涉及的
DHFR
基因序列
NCBI
数据库编号为
NC_000005.10
，
Twist1
基因和
TSC21
基因
NCBI
数据库编号分别为
NC_000005.10
和
NC_000002.12。
[0007]为实现专利技术目的，本专利技术提供的技术方案如下：本专利技术提供了一种膀胱癌检检测试剂盒，其特征在于，试剂盒内包括
DHFR PCR
反应液，
Twist1
和
TSC21 PCR
反应液，点突变阳性对照，甲基化阳性对照品，阴性对照品；所述
DHFR PCR
反应液，用于检测
DHFR
基因
(RS1650697)
是否发生点突变；所述
Twist1
和
TSC21 PCR
反应液，用于检测
Twist1
基因和
TSC21
基因启动子区域中至少一个靶区域内的甲基化程度，所述启动子区域并非严格限定为位于启动子片段内的区域，而是启动子附近区域的基因片段，
Twist1
和
TSC21
基因的甲基化检测区域均包含多个
CpG。
[0008]所述
DHFR PCR
反应液，其针对的
DHFR
基因的点突变待检区域的序列为
CTGCAGGTACTTTGTGAGTTTTGTCCTGCAGTTCCAGTTCCATGAAGCCCTGTGCAAGGAGGCAGGCTATGAGGGCCCACTGCACCAGTGTGACATCTACCGGTCCACCAAGGCAGGGGCCAAGCTCCGGTGTGTGGTGGGAAGCCGGGGGAAGTGGGAGGCAGAGAGGAGCGGCTGGCAAAGGGTGTGGCAGGAGGTGTC。
[0009]所述
Twist1
和
TSC21 PCR
反应液，其针对的
Twist1
基因的甲基化待检区域的序列为
TTCGTTTTTTAGTTTTTTTTTTTCGTTTTATTTTTTTTTTTCGGGGTTTAATAATTCGTTTTTTTAAATTATTTAAAAACGATTTGGTTCGGGCGGTCGGTTTTTTTATTCGTTTTTTAGTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGTCGTTTTTTTTCGGCGGGCGCGGGGCGATTTTTTTTTTCGTCGGAGCGTGCGGGTAGCGTTTTCGAATTTTAGCGTAGTTTAGGAAGCGGTCGGAGGAGATTGTTTTGGTCGCGGTGGTAGTTTTATTCGGAGTGGTTGTGATAGTAGTAATGGTAA
；其针对的
TSC21
基因的甲基化待检区域的序列为
TTTGACAATTTTGAGCCAGGCTTTCAGGCAGCAGAGGCCTGGGTGGCAGTCTGTGGTGTGAAGTGGATTTAGTCACACACAGTCTGATGTTGTAAACCACATGGGCTCTATTTACCTTCCTCTCCTAGGACTAGGAAGATTCTGTAGAGTATCGGAAAGCATTGGTTCATGTGCTGCCAGGATTCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种膀胱癌检检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内包括
DHFR PCR
反应液，
Twist1
和
TSC21 PCR
反应液，点突变阳性对照，甲基化阳性对照品，阴性对照品；所述
DHFR PCR
反应液，用于检测
DHFR
基因
(RS1650697)
是否发生点突变；所述
Twist1
和
TSC21 PCR
反应液，用于检测
Twist1
基因和
TSC21
基因启动子区域中至少一个靶区域内的甲基化程度，所述启动子区域并非严格限定为位于启动子片段内的区域，而是启动子附近区域的基因片段，
Twist1
和
TSC21
基因的甲基化检测区域均包含多个
CpG。2.
根据权利要求1所述的一种膀胱癌检检测试剂盒，其特征在于，所述
DHFR PCR
反应液，其针对的
DHFR
基因的点突变待检区域的序列为
CTGCAGGTACTTTGTGAGTTTTGTCCTGCAGTTCCAGTTCCATGAAGCCCTGTGCAAGGAGGCAGGCTATGAGGGCCCACTGCACCAGTGTGACATCTACCGGTCCACCAAGGCAGGGGCCAAGCTCCGGTGTGTGGTGGGAAGCCGGGGGAAGTGGGAGGCAGAGAGGAGCGGCTGGCAAAGGGTGTGGCAGGAGGTGTC。3. 根据权利要求1所述的一种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于，所述
Twist1
和
TSC21 PCR
反应液，其针对的
Twist1
基因的甲基化待检区域的序列为
TTCGTTTTTTAGTTTTTTTTTTTCGTTTTATTTTTTTTTTTCGGGGTTTAATAATTCGTTTTTTTAAATTATTTAAAAACGATTTGGTTCGGGCGGTCGGTTTTTTTATTCGTTTTTTAGTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGTCGTTTTTTTTCGGCGGGCGCGGGGCGATTTTTTTTTTCGTCGGAGCGTGCGGGTAGCGTTTTCGAATTTTAGCGTAGTTTAGGAAGCGGTCGGAGGAGATTGTTTTGGTCGCGGTGGTAGTTTTATTCGGAGTGGTTGTGATAGTAGTAATGGTAA
；其针对的
TSC21
基因的甲基化待检区域的序列为
TTTGACAATTTTGAGCCAGGCTTTCAGGCAGCAGAGGCCTGGGTGGCAGTCTGTGGTGTGAAGTGGATTTAGTCACACACAGTCTGATGTTGTAAACCACATGGGCTCTATTTACCTTCCTCTCCTAGGACTAGGAAGATTCTGTAGAGTATCGGAAAGCATTGGTTCATGTGCTGCCAGGATTCATGTTGGCTCTGGTGAGCCAGGGACAGGGAACTGACCTGCAGGCAGCCCAAGCAGCCACCTACTCACCTCACAATGACAGGGACCCTCATCATACAGGTCAGGGCTCAACTCAAAGACAGGCGTGGCAGTGGGACA。4. 根据权利要求1所述的一种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于，所述的
DHFR PCR
反应液包括
DHFR
正
、
反向引物，
DHFR
探针，内参
ACTB
正
、
反向引物，内参
ACTB
探针，
PCR
缓冲液，
MgCl
2 ，
dNTP 和
Taq
酶；所述的
Twist1
和
TSC21 PCR
反应液包括
Twist1
正
、
反向引物，
Twist1
探针，
TSC21
正
、
反向引物，
TSC21
探针，内参
ACTB
正
、
反向引物，内参
ACTB
探针，
PCR
缓冲液，
MgCl
2 ，
dNTP 和
Taq
酶
。5.
根据权利要求1所述的一种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于，所述
DHFR
正向引物的碱基序列为
TGAGTTTTGTCCTGC
，所述
DHFR
反向引物的碱基序列为
ACACCGGAGCTTGGCCCCT
，所述
DHFR
探针的碱基序列为
AGGCTATGAGGGCCCACT
；所述的
Twist1
正向引物的碱基序列为
TTTTTTTTCGGCGGGCGCGGGGCGA
，
Twist1
反向引物的碱基序列为
CCGAATAAAACTACCACCGCGACC
，
Twist1
探针的碱基序列为
TCGTCGGAGCGTGCGGGTAGC
；所述
TSC21
正向引物的碱基序列为
TTTGTAGAGTATCGGAAAGTATTGG
，
TSC21
反向引物的碱基序列为
CTATATAATAAAAATCCCTATCA
，
TSC21
探针的碱基序列为
TTTGTAGAGTATCGGAAAGTATTGG
；所述内参
ACTB
正向引物的碱基序列为
TAGGATTTTTATTTAG
，内参
ACTB
反向引物的碱基序列为
TGTGAATTTTTGTTAT
，内参
ACTB
探针的碱基序列为
TTTTAAGGGAGGAGT。6.
根据权利要求4所述的一种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于，所述
DHFR
探针
、Twist1
探针
、TSC21
探针
、ACTB
探针的两端分别标记有荧光报告基团
、
荧光淬灭基团；荧光报告基团选自
FAM、HEX、ROX、JOE、VIC、TET、NED、FITC、CY3
或
CY5
；荧光淬灭基团选自
BHQ1、B...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈梦梦，张炳强，程颖，于俊梅，栾延松，周阳，刘贺，孙静，韩丽辉，孙允东，
申请(专利权)人：青岛瑞思德医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：