调节性制造技术

本发明专利技术公开提供了来源于离体扩增的人抑制性免疫细胞，例如，调节性

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】调节性T细胞(TREG)胞外囊泡组合物和方法
[0001]相关申请
[0002]本专利技术申请主张
2021
年6月
08
日提交的美国临时专利申请
No.63/208,395
和
2021
年2月
26
日提交的美国临时专利申请
No.63/154,449
的权益，以上每项专利以其全部内容作为参考并入本文
。
1.

[0003]本专利技术公开提供了来源于离体扩增的人抑制性免疫细胞，例如，调节性
T
细胞
(Treg)
并且在疾病，如肌萎缩性脊髓侧索硬化症
(ALS)、
阿尔茨海默氏病和其它神经学疾病以及炎性
、
代谢和自体免疫疾病或功能障碍的治疗中有用的抗炎和恢复性胞外囊泡
(EV)。
2.
技术介绍

[0004]炎性和神经炎性机制有助于多种毁灭性疾病，包括神经退行性疾病，如肌萎缩性脊髓侧索硬化症
(ALS)、
帕金森氏症和多发性硬化症
。
像这样的神经退行性疾病导致巨大的健康和经济负担，其仅会随时间进一步加剧
。
[0005]目前，对于这些疾病尚无可用的疾病改善治疗
。
抗炎治疗已使用了数十年以尝试改善多种神经退行性疾病
。
然而，通过单一药物
/
靶标方法所产生的进展很小
。
[0006]越来越多的研究表明免疫系统参与像这样的疾病的病原学，并且表明作为主要疾病病理发生介体的免疫细胞的功能障碍
。
免疫系统及其成分的复杂信号转导机制和内在冗余可以帮助解释这种单一药物
/
单一靶标抗炎方法的无效性
。
[0007]最近，通过调节性
T
细胞
(Treg)
细胞疗法证实了巨大前景，所述疗法可以代表抑制有助于疾病的免疫系统功能障碍的更全局的方法
。
例如，涉及扩增的自体同源
Treg
向
ALS
患者的施用的临床试验报道在疾病的早期和晚期阶段期间
Treg
疗法减缓了发展速率，并且
Treg
的抑制功能与疾病发展的减缓相关联
(Thonhoff,J.R.
等人
,2018,Neurology
‑
Neuroimmunology Neuroinflammation 5(4))。
[0008]尽管如此，仍需要可以抑制炎性和
/
或促进抗炎免疫系统组分并且可以在疾病状况的促炎
、
毒性微环境中发挥这种作用的其它治疗的发展
。
[0009]3.
专利技术概述
[0010]本文提供了显示出令人印象深刻的体外和体内抗炎活性的胞外囊泡
(EV)。
本文所提供的
EV
来源于离体扩增的人抑制性免疫细胞，例如，调节性
T
细胞
(Treg)。
如本文中所证实的，本专利技术公开所述的
EV
保留了它们所来源的细胞的免疫抑制活性
。
此外，由于
EV
自身不是细胞，它们避免了潜在的细胞
‑
基问题，如免疫排斥和向促炎细胞类型极化的可能性
。
照此，本文所提供的抗炎
EV
对于多种疾病，如
(
例如
)
神经退行性病症，如肌萎缩性脊髓侧索硬化症
(ALS)
的治疗特别有用
。
[0011]本文所提供的结果证实经由静脉内或鼻内施用，本专利技术公开所述的
EV
能够体外有效抑制
T
应答细胞增殖和促炎脊髓活性，例如，巨噬细胞活性并且还发挥有效体内抗炎作用
。
例如，本文所提供的使用本专利技术公开的抗炎
Treg EV
组合物的体内结果在炎症模型和模
拟
ALS
的运动神经元退行性疾病模型中证实了抗炎效果
。
例如，本文所提供的结果证实
EV
能够在体内神经性炎症模型中抑制脑和外周炎症，并且还能在体内肌萎缩性脊髓侧索硬化症
(ALS)
模型中抑制炎症并延长存活
。
本文所提供的结果还证实
Treg EV
对促炎免疫细胞的抑制作用大于来源于间质干细胞
(MSC)
的
EV。
[0012]此外，本文所提供的抗炎
EV
显示出批次间显著的尺寸一致性，稳定性和活性并且显示出独特的结构特征，例如，以
Treg EV
表面标志物和
RNA
谱为特征的结构特征
。
更进一步，如本文中所证实的，无论原始
Treg
起始材料得自健康受试者还是
ALS
患者，本文所提供的方法获得了显示出类似结构和抑制活性特征的有效抗炎
EV。
[0013]在一个方面，本文提供了分离的
、
无细胞抗炎胞外囊泡
(EV)
群体，其中所述抗炎
EV
来源于离体扩增的人抑制性免疫细胞，其中：
i)
所述群体显示出约
50nm
至约
150nm
的尺寸直径分布；
ii)
所述群体包含
EV
表面
CD2、CD25
和
HLA
‑
DRDPDQ
；
iii)
所述群体包含
hsa
‑
miR
‑
1290、hsa
‑
miR
‑
146a
‑
5p
和
hsa
‑
miR
‑
155
‑
5p
微小
RNA(miRNA)
；和
iv)
所述群体显示出抑制骨髓细胞，例如，巨噬细胞的能力，如通过降低骨髓细胞的促炎细胞因子产生的能力
(
例如，显示出降低骨髓细胞中
IL
‑
6、IL
‑
8、IL1
β
或干扰素
‑
γ
的表达的能力
)
和提高骨髓细胞中一种或多种抗炎标志物的表达的能力
(
例如，提高骨髓细胞中
IL
‑
10、Arg1
和
/
或
CD206
的表达的能力
)
所测量的，或者如通过抑制应答
T
细胞增殖的能力所测量的；并且其中所述人抑制性免疫细胞是调本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
分离的
、
无细胞抗炎胞外囊泡
(EV)
群体，其中所述抗炎
EV
来源于离体扩增的人抑制性免疫细胞，其中：
i)
所述群体显示出约
50nm
至约
150nm
的尺寸直径分布；
ii)
所述群体包含
EV
表面
CD2、CD25
和
HLA
‑
DRDPDQ
；
iii)
所述群体包含
hsa
‑
miR
‑
1290、hsa
‑
miR
‑
146a
‑
5p
和
hsa
‑
miR
‑
155
‑
5p
微小
RNA(miRNA)
；和
iv)
所述群体显示出抑制骨髓细胞的能力，如通过降低骨髓细胞的促炎细胞因子产生的能力和提高骨髓细胞中一种或多种抗炎标志物的表达的能力所测量的，或者如通过抑制应答
T
细胞增殖的能力所测量的；并且其中所述人抑制性免疫细胞是调节性
T
细胞
(Treg)。2.
根据权利要求1所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体中至少约
90
％的
EV
显示出约
50nm
至约
150nm
的尺寸直径
。3.
根据权利要求1或2所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体显示出约
80nm
至约
110nm
的平均尺寸直径
。4.
根据权利要求1‑3中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体显示出约
70nm
至约
110nm
的中值尺寸直径
。5.
根据权利要求1‑4中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体显示出约
65nm
至约
95nm
的模式尺寸直径
。6.
根据权利要求1所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体中至少约
90
％的
EV
显示出约
50
至约
150nm
的尺寸直径，并且所述群体显示出约
80nm
至约
110nm
的平均尺寸直径
、
约
70nm
至约
110nm
的中值尺寸直径和约
65nm
至约
95nm
的模式尺寸直径
。7.
根据权利要求1‑6中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体还包含
EV
表面
CD44、CD29、CD4
和
CD45。8.
根据权利要求1‑7中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体还包含
EV
表面
CD9、CD63
和
CD81。9.
根据权利要求1‑8中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体显著缺少
EV
表面
CD3、CD19、CD8、CD56、CD105、CD1c、CD49e、ROR1、CD209、SSEA
‑
4、CD40、CD62P、CD11c、CD40、MSCP、CD146、CD86、CD326、CD133、CD142、CD31
和
CD14。10.
根据权利要求1或6所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体还包含
EV
表面
CD44、CD29、CD4、CD45、CD9、CD63
和
CD81
，并且其中所述群体显著缺少
EV
表面
CD3、CD19、CD8、CD56、CD105、CD1c、CD49e、ROR1、CD209、SSEA
‑
4、CD40、CD62P、CD11c、CD40、MSCP、CD146、CD86、CD326、CD133、CD142、CD31
和
CD14。11.
根据权利要求1‑
10
中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体中
hsa
‑
miR
‑
146a
‑
5p
与
hsa
‑
miR
‑
155
‑
5p
之比为约2至约
3。12.
根据权利要求1‑
11
中任一项所述的抗炎
EV
群体，
hsa
‑
miR
‑
1290
的丰度是
hsa
‑
mir
‑
155
‑
5p
的至少2倍
。13.
根据权利要求1‑
12
中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述
Treg
来自健康人受试者
。14.
根据权利要求1‑
12
中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述
Treg
来自诊断为或怀疑
患有肌萎缩性脊髓侧索硬化症
(ALS)
的人受试者
。15.
根据权利要求1‑
14
中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述抗炎
EV
显示出提高骨髓细胞中
IL
‑
10、Arg1
和
/
或
CD206
的表达的能力
。16.
根据权利要求1‑
15
中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述抗炎
EV
显示出降低骨髓细胞中
IL
‑
6、IL
‑
8、IL1
β
或干扰素
‑
γ
的表达的能力
。17.
根据权利要求1所述的抗炎
EV
群体，其中通过流式细胞术或胸腺嘧啶核苷掺入确定所述应答
T
细胞的增殖
。18.
根据权利要求1‑
17
中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述群体是含有盐水的抗炎
EV
群体
。19.
分离的
、
无细胞抗炎胞外囊泡
(EV)
群体，其中所述抗炎
EV
来源于离体扩增的人抑制性免疫细胞
。20.
根据权利要求
19
所述的抗炎
EV
群体，其中所述人抑制性免疫细胞是调节性
T
细胞
(Treg)。21.
根据权利要求
20
所述的抗炎
EV
群体，其中所述
Treg
来自健康人受试者
。22.
根据权利要求
21
所述的抗炎
EV
群体，其中所述
Treg
来自诊断为或怀疑患有神经退行性病症的人受试者
。23.
根据权利要求
22
所述的抗炎
EV
群体，其中所述神经退行性病症是阿尔茨海默氏病
。24.
根据权利要求
22
所述的抗炎
EV
群体，其中所述神经退行性病症是肌萎缩性脊髓侧索硬化症
(ALS)。25.
根据权利要求
22
所述的抗炎
EV
群体，其中所述神经退行性疾病是多发性硬化症
(MS)。26.
根据权利要求
22
所述的抗炎
EV
群体，其中所述神经退行性疾病是帕金森氏症
。27.
根据权利要求
20
所述的抗炎
EV
群体，其中所述
Treg
来自诊断患有或怀疑患有中风的人受试者
。28.
根据权利要求
20
所述的抗炎
EV
群体，其中所述
Treg
来自老年人受试者
。29.
根据权利要求
20
‑
28
中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述
Treg
来自多位人受试者
。30.
根据权利要求
29
所述的抗炎
EV
群体，其中所述
Treg
来自多位不相关的人受试者
。31.
根据权利要求
19
‑
30
中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述抗炎
EV
显示出提高炎性细胞中一种或多种抗炎标志物的表达的能力
。32.
根据权利要求
31
所述的抗炎
EV
群体，其中所述炎性细胞是骨髓细胞
。33.
根据权利要求
31
或
32
所述的抗炎
EV
群体，其中所述抗炎
EV
显示出提高炎性细胞中
IL
‑
10、Arg1
和
/
或
CD206
的表达的能力
。34.
根据权利要求
19
‑
33
中任一项所述的抗炎
EV
群体，其中所述抗炎
EV
显示出抑制炎性细胞的能力，如通过所述炎性细胞的促炎细胞因子产生所测量的
。35.
根据权利要求
34
所述的方法，其中所述炎性细胞是骨髓细胞
。36.
根据权利要求
35
所述的抗炎
EV
群体，其中所述骨髓细胞是单核细胞
、
巨噬细胞或小神经胶质细胞
。37.
根据权利要求
36
所述的抗炎
EV
群体，其中所述巨噬细胞是
M1
巨噬细胞
。
EV。57.
根据权利要求
53
所述的药物组合物，其中所述抗炎
EV
群体包含约1μ
g
至约
15mg EV。58.
根据权利要求
53
所述的药物组合物，其中所述抗炎
EV
群体包含约1μ
g
至约
15mg EV/ml。59.
根据权利要求
53
‑
58
中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是冷冻保存的药物组合物
。60.
根据权利要求
53
‑
58
中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物先前被冷冻保存
。61.
冷冻保存的组合物，其包含根据权利要求1‑
53
中任一项所述的分离的
、
无细胞抗炎
EV
群体
。62.
生产分离的
、
无细胞抗炎胞外囊泡
(EV)
群体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.
在培养基中离体扩增人抑制性免疫细胞群体以产生包含细胞
、
培养基和抗炎
EV
的培养物；和
b.
从所述培养物分离所述抗炎
EV。63.
根据权利要求
62
所述的方法，其中所述人抑制性免疫细胞群体是调节性
T
细胞
(Treg)
群体
。64.
根据权利要求
62
或
63
所述的方法，其中步骤
b)
包括从所述培养物除去细胞，然后聚乙二醇沉淀所述培养物
。65.
根据权利要求
62
或
63
所述的方法，其中步骤
b)
包括：
i)
从所述培养物除去细胞以产生含有无细胞
、
抗炎
EV
的溶液；和
ii)
从
i)
中的所述含有无细胞
、
抗炎
EV
的溶液分离所述抗炎
EV。66.
根据权利要求
65
所述的方法，其中步骤
i)
包括将所述培养物流动通过过滤器，从而通过所述过滤器保留细胞并借此从所述培养物中除去细胞
。67.
根据权利要求
65
或
66
所述的方法，其中步骤
i)
包括微滤
。68.
根据权利要求
65
‑
67
中任一项所述的方法，其中步骤
ii)
包括步骤
ii
‑
a)
：将所述含有无细胞
、
抗炎
EV
的溶液流动通过过滤器，从而通过所述过滤器保留所述抗炎
EV。69.
根据权利要求
68
所述的方法，其中所述过滤器具有约
200
千道尔顿
(kDa)
至约
600kDa
的截留分子量
(MWCO)。70.
根据权利要求
69
所述的方法，其中所述过滤器具有约
500kDa
的
MWCO。71.
根据权利要求
65
‑
70
中任一项所述的方法，其中步骤
ii)
包括超滤
。72.
根据权利要求
68
‑
71
中任一项所述的方法，其中步骤
ii)
还包括步骤
ii
‑
b)
：实施缓冲液交换，从而所产生的分离的
、
无细胞抗炎
EV
群体是含有缓冲液的分离的
、
无细胞抗炎
EV
群体
。73.
根据权利要求
72
所述的方法，其中所述缓冲液是含有盐水的缓冲液
。74.
根据权利要求
73
所述的方法，其中所述含有盐水的缓冲液是生理盐水
。75.
根据权利要求
74
所述的方法，其中所述含有盐水的缓冲液是
PBS。76.
根据权利要求
73
‑
75
中任一项所述的方法，其中步骤
ii
‑
b)
包括渗滤
。77.
根据权利要求
73
‑
76
中任一项所述的方法，其中同时实施步骤
ii
‑
a)
和
ii
‑
b)。78.
根据权利要求
62
‑
77
中任一项所述的方法，其中步骤
b)
包括切向流过滤
。
79.
根据权利要求
62
‑
78
中任一项所述的方法，其中步骤
a)
中的培养基是无血清的
。80.
根据权利要求
62
‑
79
中任一项所述的方法，其中步骤
a)
中的培养基包含血清
。81.
根据权利要求
80
所述的方法，其中所述血清是人
AB
血清
。82.
根据权利要求
80
或
81
所述的方法，其中对于血清
‑
来源的
EV
，消耗掉了血清
。83.
根据权利要求
62
‑
82
中任一项所述的方法，还包括在步骤
a)
前，从怀疑含有
Treg
的细胞样品富集
Treg
的步骤，以产生作为随后在
a)
中扩增的
Treg
群体的基线
Treg
细胞群体
。84.
根据权利要求
83
所述的方法，其中所述细胞样品是白细胞除去的细胞样品
。85.
根据权利要求
83
或
84
所述的方法，其中所述方法还包括通过白细胞除去法从供体获得所述细胞样品
。86.
根据权利要求
83
‑
85
中任一项所述的方法，其中在实施所述富集步骤之前，所述细胞样品不储存过夜或冷冻
。87.
根据权利要求
83
‑
86
中任一项所述的方法，其中在富集步骤开始之前
30
分钟内获得所述细胞样品
。88.
根据权利要求
82
‑
87
中任一项所述的方法，其中所述富集步骤包括消耗
CD8+/CD19+
细胞，然后富集
CD25+
细胞

【专利技术属性】
技术研发人员：斯坦利，
申请(专利权)人：卫理公会医院，
类型：发明
国别省市：