一种化学品发育毒性检测方法及评估模型的构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种化学品发育毒性检测方法及评估模型的构建方法与应用

【技术实现步骤摘要】
一种化学品发育毒性检测方法及评估模型的构建方法与应用


[0001]本专利技术属于毒理学
、
药理学与细胞生物学的交叉领域，具体涉及利用三维细胞模型对化学品潜在发育毒性
/
胚胎毒性进行预测和评价的方法，尤其适用于基于三维心脏细胞模型的化学品的发育毒性
/
胚胎毒性的性检测方法及评估模型的构建方法与应用
。

技术介绍

[0002]目前，化学品的毒性数据多在实验动物中获得，但是，开展动物实验存在几个不容忽视的问题：
1.
需要大量的财力，
2.
实验周期长，
3.
需要大量的实验动物，
4.
因体内影响因素较多，难以进行代谢和机制研究
。
出于动物保护而大力提倡“3R”原则，即减少
(Reduction)
，优化
(Refinement)
和替代
(Replacement)
，无论是从科学角度还是从经济角度，毒理学替代法对外源性化学物的危害评价及管理都有非常重要的意义
。
[0003]化学品申报注册的材料强制要求提供法规毒理学终点数据，包括急性毒性，慢性毒性等，致癌性等
。
生殖与发育毒性是强制要求提供数据的毒理学终点之一，因其评价周期长，所以是毒理学终点中最耗费人力和物力的一项测试
。
据市场调研数据估计，接下来的
15
年中将会有
30000
种化学品需要进行安全性测试，根据现有的测试指南，将牺牲7百万只动物，其中约
64
％是用于化学品的生殖和发育毒性评价；每检测
2000
种新化合物的发育毒性，约需耗资6亿欧元
。
而新化合物的数目以每年
1000
种递增，其中
90
％以上缺乏毒性数据，由此可见，无论是动物的使用量，还是测试过程中人力
、
物力
、
财力的消耗，都是非常巨大的
。
[0004]我国幅员辽阔，人口基数大，因此在面临评价化合物暴露导致的健康问题时情况将比其他国家更为复杂和严峻
。
随着工业的快速发展
、
城市化进程的加快，同时也带来了新型污染物及其快速扩散的问题
。
毒理学替代法的应用与推广同样适用于我国的国情
。
[0005]自
1986
年欧盟实施动物福利指导原则以来，欧盟大力支持替代法的发展与使用
。
胚胎干细胞试验是经欧洲替代方法研究中心
(EURL
‑
ECVAM)
验证的一类用于预测化合物潜在发育毒性的实验方法
。
该方法使用小鼠胚胎干细胞的分化潜能，设置分化的观察终点，结合细胞的一般毒理学数据，通过判别方程式对化合物的潜在发育毒性进行评估和分级，从而实现对化合物的安全性评价，属于一种测试方法的替代体系
。
[0006]然而，种属间可能存在的效应的差异不能忽视
。
在
20
世纪
50
年代，缓解孕妇呕吐等早孕症状的药物反应停，在小鼠
、
大鼠等实验动物中未观察到明显的发育毒性，因此，在以欧洲为主的多个地区被大量地使用，其结局就是导致了数以万计的“海豹儿”的诞生
。
这一事件使种属间差异性得到了史无前例的关注，它将基于“人”的毒性测试及机制研究推上了新的历史舞台
。
受医学伦理学的约束，目前，国际上的安全性评价测试方法仍以动物
、
细胞为主，除了新开发的
、
安全性有前临床实验结果保障的
、
具有极大治疗潜能的药物外，几乎没有化学物质可获得“人体试验”的允许
。
因此，从毒理学替代法的角度出发，如何建立可准确反映人类生物学特征的安全性评价体系和方法，对保障人类的健康具有非常重大的意义
。
[0007]人多能干细胞
(human pluripotent stem cell,hPSC)
或人诱导多能干细胞
(human induced pluripotent stem cells,hiPSC)
具有强大的自我更新能力及分化潜能，可在体外经诱导分化为多个组织器官来源的细胞，且表达各细胞特异性的标志物，具有各类型细胞的基本形态学
、
生理学功能
。
通过选择多个观察终点，可以分别评估化合物对相应器官组织的潜在毒性，并且在整个实验过程中都不需要用到活体的动物，节约人力
、
物力
、
财力和时间，可重复性强，易于操作，符合国际上化合物毒性评价替代研究的要求
。
[0008]利用
hPSC
或
hiPSC
，可从细胞水平分析发育过程，并判断某因素是否具备发育
/
胚胎毒性或致畸潜能
。
目前，多选择心肌细胞作为分化发育后的衡量指标，其原因有：第一
、
心脏发育始于胚胎发育早期，使得在体外通过诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞模拟体内的心脏发育过程较易实现；第二
、
心脏发育是一个高度特化的过程，对发育过程的细微干扰即可导致心脏发育出现异常，因而具备较灵敏的识别外源性化合物诱导发育毒性的能力
。
特别地，利用人来源的
PSC
或
iPSC
，以及由这两类细胞诱导分化获得的心肌细胞及三维心脏类器官，与化合物相互作用时，可直接反映人源的毒性效应和特征，提示化合物对人类的健康危害，较其他种属细胞具有明显优势
。
[0009]目前，国际上的安全性评价测试方法仍以动物
、
细胞为主，除了新开发的
、
安全性有前临床实验结果保障的
、
具有极大治疗潜能的药物外，几乎没有化学物质可获得“人体试验”的允许
。
因此，从毒理学替代法的角度出发，建立可准确反映人类生物学特征的毒性测试方法，评价化合物对人类的健康危害，对保障人类的健康具有非常重大的意义
。
[0010]各毒理学终点的毒性效应指标
、
检测方法和毒性评价模型具有各自对应的适用对象和范围，超出适用对象和范围的毒性评价结果存在较高的“误判
、
漏判”风险
、
具有较大的不准确性
。
目前已有的发育毒性评价方法和均基于二维培养的细胞，或使用分化效能较低的胚胎干细胞及其来源的拟胚体，尚缺少与分化程度较高的三维心肌细胞模型配套的发育毒性评价模型和方法
。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的在于提供一种化学品发育毒性检测方法及评估模型的构建方法与应用
。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种化学品发育毒性检测方法，包括：所述检测方法是利用人多能干细胞系
hPSC
或人诱导多能干细胞
hiPSC
来源的三维体外心脏模型，以待测化学品的细胞毒性指标
IC
50
和及分化抑制指标
ID
50
的数值为指标，判断待测化学品的发育毒性
。2.
根据权利要求1所述的一种化学品发育毒性检测方法，其特征在于：所述检测方法包括：
1)
分别在有待测化学品和无待测化学品的培养条件下，诱导未分化的人多能干细胞系
hPSC
或人诱导多能干细胞
hiPSC
分化为三维体外心脏模型；
2)
分别测定在有待测化学品和无待测化学品的培养条件下，诱导分化获得的三维体外心脏模型的直径和含腔率，获得与无待测化学品的培养条件相比，有待测化学品的培养条件下的细胞毒性指标
IC
50
和分化抑制指标
ID
50
的数值；
3)
依据计算公式，判断待测化学品的发育毒性
。3.
根据权利要求2所述的一种化学品发育毒性检测方法，其特征在于：所述待测化学品的细胞毒性指标
IC
50
是指与无待测化学品培养条件相比，有待测化学品的培养条件下，所述三维体外心脏模型的直径减少
50
％时的化合物浓度
IC
50
；当
IC
50
大于
1000
μ
M
时，按
1000
μ
M
计
。4.
根据权利要求2所述的一种化学品发育毒性检测方法，其特征在于：所述待测化学品的分化抑制指标
ID
50
是指与无待测化学品培养条件相比，有待测化学品的培养条件下，所述三维体外心脏模型的含腔率减少
50
％时的化合物浓度
ID
50
；当
ID
50
大于
1000
μ
M
时，按
1000
μ
M
计
。5.
根据权利要求1所述的一种化学品发育毒性检测方法，其特征在于：所述判断待测化学品的发育毒性是通过数学模型判断待测化学品的发育毒性
。6.
根据权利要求5所述的一种化学品发育毒性检测方法，其特征在于：所述数学模型为3个
Fisher
判别函数方程：
I
：
‑
94.072+74.257
×
log10 IC
50
–
12.275
×
log10 ID
50
–
63.336
×
log10(|IC
50
–
ID
50
|)II
：
‑
3.733+6.740
×
log10 IC
50
–
0.605
×
log10 ID
50
–
4.719
×
log10(|IC
50
–
ID
50
|)III
：
‑
3.887+12.582
×
log10 IC
50
–
3.148
×
log10 ID
50
–
10.032
×
log10(IC
50
–
ID
50
|)
其中，所述待测化学品的细胞毒性指标
IC
50
是指与无待测化学品培养条件相比，有待测化学品的培养条件下，所述三维体外心脏模型的直径减少
50
％时的化合物浓度
IC
50
；所述待测化学品的分化抑制指标
ID
50
是指与无待测化学品培养条件相比，有待测化学品的培养条件下，所述三维体外心脏模型的含腔率减少<...

【专利技术属性】
技术研发人员：程薇，王艳，周悦，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：