一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法，涉及病毒影响猪睾丸细胞技术领域，具体为一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法，包括以下材料的准备；猪睾丸支持细胞

【技术实现步骤摘要】
一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法


[0001]本专利技术涉及病毒影响猪睾丸细胞
，具体为一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法
。

技术介绍

[0002]目前未有明确机制说明猪瘟病毒感染导致精液带毒的原因
。
公猪感染猪瘟病毒后精液带毒
、
品质下降，并可通过精液感染母猪，是造成猪繁殖障碍问题的重要原因之一
。
[0003]公猪睾丸存在血睾屏障结构，为精子发生提供相对独立
、
安全的微环境
。
睾丸支持细胞是构成血睾屏障的重要组成细胞，参与血睾屏障的形成
。
一旦血睾屏障受损，就会导致有害因子进入精细管腔损害生精细胞
。
猪瘟病毒能出现在精液中是否破坏了血睾屏障，是否影响组成血睾屏障的重要细胞
‑
支持细胞的屏障和渗透性
。
[0004]于是我们通过对单层支持细胞电阻和渗透性检测，评估猪瘟病毒对细胞屏障功能的影响
。
同时通过
WB
方法验证猪瘟病毒对屏障结构紧密相关的细胞间连接蛋白进行验证
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法，解决了上述
技术介绍
中提出的问题
。
[0006]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法，包括以下材料的准备；
>[0007]猪睾丸支持细胞
、CSFV
病毒液
、DMEM
完全培养基
、DMEM
基础培养基
、HBSS
缓冲液
、FITC
标记葡聚糖荧光素
、
兔源抗
ZO
‑1蛋白
、occludin
的蛋白
、connexin43
蛋白和猪瘟病毒
E2
蛋白的抗体
、Transwell
小室
、12
孔细胞培养板
、96
孔避光板
、
电阻仪
、
荧光酶标仪；
[0008]检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法的具体步骤如下：
[0009]S1、Transwell
小室的活化与病毒灭活的准备；
[0010](1)
实验开始前准备，向每个
Transwell
上室加入
0.5mL
完全培养基将上室底膜过夜水化；
[0011](2)
取
CSFV
病毒液室温融化，添加适量病毒液于培养皿中，放入无菌操作台中，暴露紫外照射
2h
，回收灭活毒液
‑
20℃
存放备用；
[0012]S2、
细胞跨膜电阻的检测；
[0013](1)
将
T25
培养瓶中生长状态良好的猪睾丸支持细胞加
1.5mL
胰酶消化
3min
，弃胰酶加
3mL
完全培养基吹打细胞直至脱落；
[0014](2)
将细胞液转移至
15mL
离心管中离心，
1000rpm/4min
，弃上清，加入
3mL
完全培养基重悬混匀，接种
250
μ
L
至上室使每孔细胞覆盖底膜面积占比
50
％左右，上室补
250
μ
L
完全培养基，下室加入
1mL
完全培养基，
24h
后细胞完全贴壁；
[0015](3)
将镊子废液缸等实验必需器材酒精喷洒表面后放入生物安全柜紫外灭菌
10min
，灭菌结束，将
Transwell
板从二氧化碳培养箱轻轻取出显微镜观察细胞密度及污染
情况；
[0016](4)
开启生物安全柜，将电阻仪双电极用
75
％酒精棉球消毒风干后，打开电阻仪并调节拨杆至“Ω”档位，将双电极竖直放入
37℃
预热
HBSS
中平衡
10min
；
[0017](5)
镊子夹起上室一侧倾倒培养基，向上室加入
37℃
预热
HBSS 0.5mL
，下室加入
1mL HBSS
，平衡
10min
后移除
HBSS
，加入等量
37℃
预热
HBSS
，将双电极较短一侧沿上室壁竖直下移至上室底膜上缘，较长一侧沿上室边缘孔贯穿至下室；
[0018]依据此方法，每一次测值遵循同位同处理原则，双电极保持在上下室的相同部位测值；每个小室测定三个不同方位的值；移除
HBSS
，添加等量完全培养基，放回培养箱中；
[0019]S3、
细胞接毒后跨膜电阻的检测；
[0020](1)
细胞培养至完全覆盖底膜时，保持每日电阻检测，待
TEER
值恒定并维持恒定值满3日后，取出
Transwell
板放入生物安全柜，换液；
[0021](2)
每个
12
孔
Transwell
板设四个接毒时间处理组，其中接毒处理方式为每孔接种
50
μ
L CSFV
病毒液，待病毒液吸附细胞
2h
后换
DMEM
基础培养基；
[0022](3)
接灭活毒处理方式为每孔接种
50
μ
L
灭活
CSFV
病毒液，
2h
后换液；
[0023](4)
空白组细胞除同步换液之外不做任何处理；到达对应时间点后测值，
{C
样
TEER
值＝
(C
测定电阻值
‑
空白电阻值
)X
膜表面积
[
Ω
/cm2]}
；
[0024]S4、
渗透性检测；
[0025](1)
取
FITC
‑
dextran
粉末用
HBSS
缓冲液配制成终浓度为
1mg/mL
的工作液；
[0026](2)
对应时间的
TEER
值测量结束后，将上层及下层
HBSS
弃掉，下层换新预热
HBSS1mL
，上层加入
0.5mL FITC
‑
dextran
工作液，培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法，其特征在于：包括以下材料的准备；猪睾丸支持细胞
、CSFV
病毒液
、DMEM
完全培养基
、DMEM
基础培养基
、HBSS
缓冲液
、FITC
标记葡聚糖荧光素
、
兔源抗
ZO
‑1蛋白
、occludin
的蛋白
、connexin43
蛋白和猪瘟病毒
E2
蛋白的抗体
、Transwell
小室
、12
孔细胞培养板
、96
孔避光板
、
电阻仪
、
荧光酶标仪；检测病毒影响猪睾丸支持细胞屏障功能的方法的具体步骤如下：
S1、Transwell
小室的活化与病毒灭活的准备；
(1)
实验开始前准备，向每个
Transwell
上室加入
0.5mL
完全培养基将上室底膜过夜水化；
(2)
取
CSFV
病毒液室温融化，添加适量病毒液于培养皿中，放入无菌操作台中，暴露紫外照射
2h
，回收灭活毒液
‑
20℃
存放备用；
S2、
细胞跨膜电阻的检测；
(1)
将
T25
培养瓶中生长状态良好的猪睾丸支持细胞加
1.5mL
胰酶消化
3min
，弃胰酶加
3mL
完全培养基吹打细胞直至脱落；
(2)
将细胞液转移至
15mL
离心管中离心，
1000rpm/4min
，弃上清，加入
3mL
完全培养基重悬混匀，接种
250
μ
L
至上室使每孔细胞覆盖底膜面积占比
50
％左右，上室补
250
μ
L
完全培养基，下室加入
1mL
完全培养基，
24h
后细胞完全贴壁；
(3)
将镊子废液缸等实验必需器材酒精喷洒表面后放入生物安全柜紫外灭菌
10min
，灭菌结束，将
Transwell
板从二氧化碳培养箱轻轻取出显微镜观察细胞密度及污染情况；
(4)
开启生物安全柜，将电阻仪双电极用
75
％酒精棉球消毒风干后，打开电阻仪并调节拨杆至“Ω”档位，将双电极竖直放入
37℃
预热
HBSS
中平衡
10min
；
(5)
镊子夹起上室一侧倾倒培养基，向上室加入
37℃
预热
HBSS 0.5mL
，下室加入
1mL HBSS
，平衡
10min
后移除
HBSS
，加入等量
37℃
预热
HBSS
，将双电极较短一侧沿上室壁竖直下移至上室底膜上缘，较长一侧沿上室边缘孔贯穿至下室；依据此方法，每一次测值遵循同位同处理原则，双电极保持在上下室的相同部位测值；每个小室测定三个不同方位的值；移除
HBSS
，添加等量完全培养基，放回培养箱中；
S3、
细胞接毒后跨膜电阻的检测；
(1)
细胞培养至完全覆盖底膜时，保持每日电阻检测，待
TEER
值恒定并维持恒定值满3日后，取出
Transwell
板放入生物安全柜，换液；
(2)
每个
12
孔
Transwell
板设四个接毒时间处理组，其中接毒处理方式为每孔接种
50
μ
L CSFV
病毒液，待病毒液吸附细胞
2h
后换
DMEM
基础培养基；
(3)
接灭活毒处理方式为每孔接种
50
μ
L
灭活
CSFV
病毒液，
2h
后换液；
(4)
空白组细胞除同步换液之外不做任何处理；到达对应时间点后测值，
{C
样
TEER
值＝
(C
测定电阻值
‑
空白电阻值
)X
膜表面积
[
Ω
/cm2]}
；
S4、
渗透性检测；
(1)
取
FITC
‑
dextran
粉末用
HBSS
缓冲液配制成终浓度为
1mg/mL
的工作液；
(2)
对应时间的
TEER
值测量结束后，将上层及下层
HBSS
弃掉，下层换新预热
HBSS1mL
，上层加入
0.5mL FITC
‑
dextran
工作液，培养箱中静置
1h
；
(3)
取全黑避光
96
孔板，取
Transwell
板，放入无菌操作台中，避光板每个待检孔加入
100
μ
L
下室样本；
S5、Westernblot
；
(1)
细胞接毒试验与蛋白样提取；细胞分为试验组与对照组，向六孔板接种猪睾丸支持细胞，细胞贴壁后，按照
12、24、36、48h
四个时间点接毒并在对应时间点提取蛋白样；
(2)
蛋白变性与电泳；其中蛋白变性条件为
99℃
煮
10min
；
(a)
使用
10
％的浓缩胶与分离胶，配制完成灌注
、
凝固...

【专利技术属性】
技术研发人员：康恺，吴江，马尧丹，余晖，效梅，安立龙，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：