一种分离外泌体中制造技术

本发明专利技术公开了一种分离外泌体中

【技术实现步骤摘要】
一种分离外泌体中ecDNA的方法及ecDNA提取试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种分离外泌体中
ecDNA
的方法及
ecDNA
提取试剂盒
。

技术介绍

[0002]外泌体
(exosome)
是一种
30
‑
150nm
大小
、
极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞
‑
融合
‑
外排”等一系列调控过程而形成
。
几乎所有细胞都会分泌外泌体，细胞分泌的外泌体携带了来源细胞的诸多生物学信息，因此，外泌体也被认为是重要的潜在生物标记物，可以及时的反映来源细胞的生理与病理状态
。
[0003]ecDNA(
染色体外
DNA)
是近期肿瘤学领域的研究热点，国内外的相关研究还处于起步阶段
。ecDNA
指的是从染色体上脱落，脱离染色体以环状结构存在的
DNA。
研究表明
ecDNA
普遍存在于肿瘤细胞中，是原癌基因的载体，是肿瘤异质性的驱动力之一，会推动肿瘤的快速演化，并可能与肿瘤的耐药相关
。
目前关于
ecDNA
的研究较少，结合外泌体和
ecDNA
的研究更少，没有相关的专利文献发表出来
。
[0004]目前，可查询的文献报道目前关于
ecDNA
提取的方法主要是采用氯化铯梯度离心法进行提取：
[0005]氯化铯梯度离心法亦称平衡密度梯度离心法，用超速离心机对小分子物质溶液长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度
。
溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物
。
经过高速离心后
DNA、RNA
等物质会形成一个连续的浓度梯度，
ecDNA
会悬浮于某一层，进而可以收集纯化获得较高纯度的
ecDNA。
[0006]氯化铯梯度离心法有诸多缺点：
1)
实验过程中使用氯化铯以及溴化乙锭均为有毒试剂，对操作人员身体和环境可能造成危害
。2)
离心次数较多，需用到超速离心机，且必须在专业人士培训后方可进行操作
。3)
实验操作比较复杂，
ecDNA
分层吸取技术较难
。4)
实验时间过长
。5)
无法自动化
。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是，提供一种外泌体中
ecDNA
的分离方法及试剂盒
。
主要解决现有技术中氯化铯梯度离心法提取
ecDNA
存在操作复杂
、
成本高
、
效率低的问题
。
[0008]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0009]一种分离外泌体中
ecDNA
的方法，该方法包括：
[0010]采用磁珠悬液Ⅰ吸附样本中的外泌体，然后对吸附外泌体的磁珠采用裂解液进行处理；所述磁珠悬液Ⅰ中的磁珠表面包被有能够特异性结合外泌体的抗体和
IgG
，所述裂解液中含有至少
0.5M
的高盐组分
。
[0011]作为优选实施方案，所述磁珠表面包被
CD9、CD63、CD81
和
IgG
抗体
。
[0012]作为优选实施方案，所述
IgG
抗体在磁珠悬液Ⅰ中的浓度为
0.1
‑
2.0mg/mL
，优选为
0.1mg/mL。
[0013]作为优选实施方案，所述磁珠悬液Ⅰ中的磁珠为硅羟基磁珠，浓度为
0.1
‑
10mg/mL
，优选为
2mg/mL。
[0014]作为优选实施方案，所述裂解液的高盐组分为钠盐或钾盐，浓度为
0.5
‑
5M。
[0015]作为优选实施方案，所述裂解液的组成为：质量百分比1‑
10
％的聚多卡醇
、0.5
‑
5M
的
NaCl、PH
值8‑
12
；其中
PH
值优选为
10
‑
12。
[0016]作为优选实施方案，所述裂解液的组成为：
5wt
％的聚多卡醇
、3M
的
NaCl
，
PH
值为
10.5。
[0017]作为优选实施方案，所述磁珠悬液Ⅰ与样本混匀孵育，离心，吸磁后弃除上清；然后加入裂解液，混匀孵育，离心，吸磁后弃除上清
。
[0018]作为优选实施方案，所述裂解液处理后，加入洗涤液，充分洗涤后离心，取上清；所述洗涤液包括浓度为
0.1
‑
5mg/mL
的蛋白酶
K
，优选为
0.5mg/mL。
[0019]作为优选实施方案，所述洗涤液处理后，加入磁珠悬液Ⅱ充分混匀，离心，吸磁后弃除上清；所述磁珠悬液Ⅱ含有
0.1
‑
5mg/mL
的羟基磁珠，优选为
0.5mg/mL。
[0020]作为优选实施方案，所述磁珠悬液Ⅱ处理后加入洗脱液，充分混匀后，离心，吸磁后留取洗脱液；所述洗脱液的组成为5‑
20mmol/L
的
Tris
‑
HCL
，优选为
10mmol/L
的
Tris
‑
HCL。
[0021]本专利技术还提供一种外泌体中
ecDNA
的提取试剂盒，所述试剂盒包括磁珠悬液Ⅰ、
裂解液
、
洗涤液
、
磁珠悬液Ⅱ、
洗脱液；
[0022]所述磁珠悬液Ⅰ含有
0.1
‑
10mg/mL
的硅羟基磁珠，硅羟基磁珠表面包被有能够特异性结合外泌体的抗体和
IgG
；所述
IgG
抗体在磁珠悬液Ⅰ中的浓度为
0.1
‑
2.0mg/mL
；
[0023]所述裂解液的组成为质量百分比1‑
10
％的聚多卡醇
、0.5
‑
5M
的
NaCl
或
KCl、PH
值8‑
12
；其中
PH
值优选为
10
‑
12
；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种分离外泌体中
ecDNA
的方法，该方法包括：采用磁珠悬液Ⅰ吸附样本中的外泌体，然后对吸附外泌体的磁珠采用裂解液进行处理；所述磁珠悬液Ⅰ中的磁珠表面包被有能够特异性结合外泌体的抗体和
IgG
，所述裂解液中含有至少
0.5M
的高盐组分
。2.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述磁珠表面包被
CD9、CD63、CD81
和
IgG
抗体
。3.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述
IgG
抗体在磁珠悬液Ⅰ中的浓度为
0.1
‑
2.0mg/mL。4.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述磁珠悬液Ⅰ中的磁珠为硅羟基磁珠，浓度为
0.1
‑
10mg/mL
，优选为
2mg/mL。5.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述裂解液的高盐组分为钠盐或钾盐，浓度为
0.5
‑
5M。6.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述裂解液的组成为：质量百分比1‑
10
％的聚多卡醇
、0.5
‑
5M
的
NaCl、PH
值8‑
12
；其中
PH
值优选为
10
‑
12。7.
根据权利要求6所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述裂解液的组成为：
5wt
％的聚多卡醇
、3M
的
NaCl
，
PH
值为
10.5。8.
根据权利要求1所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述磁珠悬液Ⅰ与样本混匀孵育，离心，吸磁后弃除上清；然后加入裂解液，混匀孵育，离心，吸磁后弃除上清
。9.
根据权利要求8所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述裂解液处理后，加入洗涤液，充分洗涤后离心，取上清；所述洗涤液包括浓度为
0.1
‑
5mg/mL
的蛋白酶
K
，优选为
0.5mg/mL。10.
根据权利要求9所述的外泌体中
ecDNA
的分离方法，其特征在于：所述洗涤液处理后，加入磁珠悬液Ⅱ充分混匀，离心，吸磁后...

【专利技术属性】
技术研发人员：马跃，赵小玉，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：